Trabajo experimental sobre el trasplante de queratinocitos alogénicos en cicatrices creadas artificialmente en ratas blancas.

El deseo de utilizar el potencial celular y la necesidad de encontrar nuevos métodos efectivos para mejorar el aspecto estético de las cicatrices llevaron a la idea de intentar estudiar la posibilidad de trasplantar queratinocitos a las superficies de las cicatrices.

Para demostrar la probabilidad de usar cultivos de queratinocitos para mejorar la apariencia de las cicatrices, se realizó un estudio experimental con ratas blancas de laboratorio, a las que se les crearon superficies cicatriciales. El modelo de cicatriz de rata se obtuvo mediante la cicatrización artificial de heridas en la espalda, a lo largo de la columna vertebral. Se cortaron fragmentos idénticos de piel de las ratas, de 2 x 3 cm. Dos meses y medio después de la operación de "modelado de cicatrices", las ratas se sometieron a dermoabrasión (extirpación de las capas superiores de la cicatriz mediante termocáustico) y se trasplantaron queratinocitos alogénicos, aislados de la piel de crías de rata entre dos y cuatro días después del nacimiento.

El aislamiento y cultivo de células epidérmicas de rata se llevó a cabo en el laboratorio de tecnologías celulares del Instituto de Citología de la Academia de Ciencias de Rusia utilizando la siguiente tecnología.

La piel se lavó con solución salina de Hank que contenía 200 U/ml de gentamicina y se cortó en pequeños trozos de 0,2-0,5 cm² de área ^. Los trozos de piel se incubaron en una solución de dispasa al 0,5% en una solución salina tamponada con fosfato a 37 °C durante 1 hora. A continuación, los trozos se transfirieron a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco y la epidermis se separó de la dermis. La epidermis se incubó en una solución de tripsina al 0,125% durante 10-15 minutos con agitación a 50 rpm, tras lo cual se detuvo la acción enzimática añadiendo suero fetal bovino al 5%. Un tercio de la suspensión celular resultante se utilizó en forma pura para una de las opciones de trasplante sobre cicatrices, el segundo tercio se cultivó en recubrimientos de película domésticos biocompatibles "Polypor" y el tercero, en placas de Petri sin sustrato. La operación de dermoabrasión de las cicatrices resultantes en ratas con posterior trasplante de células epidérmicas de rata sobre ellas se realizó bajo anestesia con éter utilizando un cauterizador térmico.

En el primer grupo de ratas, tras la dermoabrasión, se colocaron trozos estériles de batista sobre la superficie pulida, lavada con solución fisiológica y seca de la cicatriz. Sobre ellos se aplicó una suspensión agitada de epidermocitos alogénicos de rata a una concentración de 1,5 millones de células por ml (según el Instituto de Citología). Los trozos de batista se colocaron sobre la cicatriz pulida de forma que las células quedaran sobre la superficie. Se colocó encima un vendaje de varias capas de gasa, que se suturó a los bordes de la cicatriz.

Parte de la suspensión celular obtenida se sembró en placas de Petri sobre películas estériles de Polypore cortadas a la forma de las placas, la otra parte, en placas de Petri sin película. El cultivo se realizó en medio FAD, que consiste en una mezcla de medio DMEM y F12 en una proporción de 3:1. con la adición de 10% de suero bovino fetal, 5 μg / ml de insulina (Sigma), 0,5 μg / ml de hemisuccinato de hidrocortisona (Sigma), 10 μg / ml de factor de crecimiento epidérmico EGF (Instituto de Citología RAS, San Petersburgo). El segundo y tercer grupo de ratas, 7 individuos cada uno, fueron operados 6 días después del primero. Para entonces, se formaron capas multicapa a partir de la suspensión de queratinocitos sembrados en las placas de Petri, que se trasplantaron a las ratas. El segundo grupo fue trasplantado con epidermocitos en una película, el tercero, con una capa multicapa sin sustrato. Tras 7 días, las capas multicapa de queratinocitos alogénicos (MPALK) obtenidas, sembradas en las películas "Polypore", se trasplantaron como cultivo directamente a la superficie de la herida. Para evitar que se desgarrara, la película se fijó con una gasa multicapa y se suturó a la piel de las ratas.

Antes de trasplantar queratinocitos al tercer grupo de ratas cultivadas sin sustrato, el PAC se separó del fondo de la placa de Petri mediante tratamiento con dispasa, que tiene la capacidad de romper selectivamente las uniones dermoepidérmicas. Al actuar sobre una capa multicapa, la dispasa rompe la conexión de las células de la capa basal con el fondo de la placa de Petri y tiene un efecto mucho menor en las conexiones intercelulares, lo que permite eliminar la capa por completo. El desprendimiento de la capa celular multicapa con dispasa se realizó de la siguiente manera: se drenó el medio de transporte de las placas de Petri y las capas celulares se lavaron tres veces con un medio nutritivo que contenía antibióticos, en particular gentamicina (0,2 mg/ml). Las capas multicapa se llenaron con solución de dispasa al 0,125 % («Sigma») y se colocaron en un termostato, donde se incubaron a t=37 °C durante 20-30 minutos. La aparición de un borde blanco que se desprende a lo largo de la periferia de la capa indica el inicio de su separación de los bordes y el fondo de la placa de Petri. Unos minutos después de iniciar la separación, se drenó la solución de dispasa y las capas epiteliales se lavaron 2-3 veces con el medio. Se aplicó un trozo de apósito estéril "Lita-color", cortado al tamaño de la copa, sobre la superficie de la capa epidérmica, y se pegó la capa separada por la dispasa, desprendida adicionalmente del fondo de la copa con una espátula. Con unas pinzas, se desprendió la capa, junto con el recubrimiento de la servilleta "Lita-color" (Rusia), del fondo de la placa de Petri y se transfirió cuidadosamente a la superficie preparada de la cicatriz. Las servilletas "Lita-color" contienen gentamicina y exolina (extracto de colágeno), que, al humedecerse con los restos del medio de crecimiento y luego con una solución fisiológica, se hinchan y se convierten en un moderno apósito para heridas, proporcionando una buena protección contra infecciones externas y una rápida curación debido a la estructura que absorbe la humedad.

Se aplicaron vendajes de gasa multicapa a las películas de Polypore y a las compresas Lita-color, y se cosieron a la piel de las ratas para una fijación más firme. Cada rata se colocó en una jaula separada para crear las condiciones óptimas para su mantenimiento y el injerto de los queratinocitos trasplantados. Los vendajes de las ratas a las que se trasplantaron la suspensión y la capa multicapa de epidermocitos extraídos mediante dispasa se humedecieron con solución salina estéril varias veces al día para crear las condiciones más favorables para el injerto de las células. Dado que la película de Polypore era impermeable al agua, los vendajes de las ratas del segundo grupo no se humedecieron, lo cual constituyó una de las ventajas sobre los trasplantes sin películas. Los vendajes se retiraron a los 10 días. El cuadro clínico de las cicatrices tras el trasplante celular difirió poco del de las cicatrices sin trasplante, salvo por su color más rosado (debido a la dermoabrasión) y una mayor descamación. Esto sugiere que, inmediatamente después de retirar los apósitos de la herida con el MPC, no se observaron cambios en la cicatriz.

Toma de material de biopsia de ratas.

Tras 1, 2, 5 y 9 meses del trasplante de queratinocitos alogénicos de rata sobre cicatrices pulidas de ratas blancas, se tomó material para su examen histológico, citomorfológico y microscópico electrónico. Se tomaron muestras de piel de rata normal y de cicatriz sin trasplante celular como control. Las ratas se anestesiaron con éter.

Tras la anestesia, se extrajeron fragmentos de tejido cicatricial de las zonas marcadas donde se trasplantaron queratinocitos con un sacabocados de biopsia de 2 mm de diámetro. Estos fragmentos se colocaron en una solución de glutaraldehído al 2,5 % para preparar el material para su examen con microscopio electrónico. Los fragmentos de tejido extraídos para el examen histológico se colocaron en una solución de formalina neutra al 10 %, se pasaron por alcoholes y se incluyeron en parafina, y posteriormente se cortaron secciones ultrafinas para su observación en un microscopio óptico.

Control I. Piel de rata normal.

Para ver la diferencia entre la imagen microscópica de la piel de rata normal alterada por cicatrices y las cicatrices en ciertos momentos después del trasplante de MPC, se muestran fotografías y descripciones de ellas en todas las etapas de este estudio.

La epidermis de la piel normal consta de 7-9 capas de células. El estrato córneo es de grosor moderado. En algunos lugares consta de 6-8 capas de escamas córneas. La capa basal está representada por células cilíndricas con núcleos grandes, ligeros y de forma regular, y varios nucléolos. Las conexiones desmosómicas entre las células y con la membrana basal son claramente visibles. Bajo la membrana basal bien definida, que presenta pequeñas excrecencias en la capa subepidérmica, paralelamente se encuentran delicados haces de fibras de colágeno y elastina, entre los que se encuentran fibroblastos alargados y pequeños vasos. En capas más profundas, los haces de fibras de colágeno y elastina se encuentran en diferentes direcciones. Entre ellos se encuentran numerosos vasos con paredes delgadas del mismo calibre, elementos celulares (fibroblastos, mastocitos, leucocitos). Una gran cantidad de folículos pilosos y glándulas sebáceas.

Control 2. Cicatriz de rata, 2 meses de antigüedad.

Cuadro clínico. Las cicatrices son de color rosa pálido, presentan descamación y algunas costras. Su superficie ha disminuido debido a la contracción de las fibras de colágeno y ha alcanzado aproximadamente 3,0-3,5 cm ^. No hay anejos cutáneos.

Imagen microscópica. La epidermis consta de 3 a 5 capas de células plegadas, representadas por células basales redondeadas, una fila de células subuladas y 1 o 2 filas de células granulares con granos de queratohialina en la capa superior. Se observan áreas de edema intracelular. El estrato córneo presenta cambios irregulares, de muy fino a engrosado. Se observan pliegues cicatriciales debido a la contracción del tejido cicatricial. Los pliegues penetran en la capa papilar y crean la impresión de papilas. El límite entre la epidermis y la dermis es una línea recta. La membrana basal no se traza en todas partes. En la parte inferior de las capas subepidérmicas y más profundas hay vasos con una pared gruesa y laxa; muchos están vacíos y presentan estasis. Alrededor de los vasos se acumulan macrófagos y fibroblastos. Los macrófagos rodean los eritrocitos liberados de los capilares y los fagocitan. En las capas más superficiales hay pequeños capilares. Bajo la epidermis, las fibras de colágeno se encuentran laxas. En la capa más profunda de la cicatriz hay haces gruesos de fibras de colágeno, entre los que hay muchos fibroblastos.

Cicatriz de rata un mes después del trasplante de queratinocitos de rata.

Cuadro clínico. Las cicatrices son rosadas, su superficie ha disminuido, especialmente en diámetro, y su promedio es de 2,5 a 3 cm² ^. No hay pelo ni glándulas sebáceas.

Los datos del examen microscópico del material obtenido de ratas con trasplante de MPaLK en película y MPaLK sin sustrato son prácticamente idénticos. Sin embargo, desde un punto de vista técnico, trabajar con MPaLK sin sustrato es mucho más complejo y laborioso que cultivar MPaLK sobre sustrato. Por lo tanto, para profundizar en el estudio del trasplante de queratinocitos a cicatrices, utilizamos batista multicapa como base de cultivo (sustratos).

Imagen microscópica. Se observa un engrosamiento de la epidermis de 15 a 20 capas, casi en la mitad de las cuales los queratinocitos presentan una forma estrecha, alargada y vertical, y una disposición compacta. Las células basales se disponen en una línea irregular. Sus núcleos son ligeros, grandes y redondeados, con uno o dos nucléolos, lo que indica su alta actividad sintética y proliferativa. El límite entre la epidermis y la dermis es una línea recta. La capa espinosa está bien desarrollada y consta de 3 a 5 capas de células redondeadas, con células binucleolares.

Inmediatamente debajo de la membrana basal se encuentran haces delgados y densos de fibras de colágeno. Paralelamente, se observa una gran cantidad de vasos sanguíneos deshabitados. Las fibras de colágeno más profundas son más gruesas y se agrupan en haces densos. Se observan numerosos fibroblastos grandes, mastocitos (2-3 en el campo visual), macrófagos, leucocitos y vasos sanguíneos deshabitados, cuyas paredes están desprendidas. A su alrededor, se observan fibras de colágeno desprendidas. En algunos vasos se observa estasis y diapédesis de elementos formes. Alrededor de los vasos se encuentran fibroblastos y linfocitos aislados. No se observan apéndices cutáneos.

Al trasplantar una suspensión de queratinocitos a una cicatriz pulida, la imagen microscópica difiere de la anterior. En la mayoría de los animales, la epidermis es delgada y consta de 5-6 capas de células. La capa inferior está formada por células de forma irregular y poligonal con núcleos redondos e irregulares. El estado de la capa subepidérmica es similar al del grupo de animales sin trasplante de MPALK.

En este caso, podemos hablar de un retraso en los procesos que acompañan al trasplante celular o de una gran pérdida de células trasplantadas en suspensión. Por lo tanto, se concluyó que la corrección de cicatrices mediante el trasplante de queratinocitos en suspensión es ineficaz.

Cicatriz de rata 2 meses después del trasplante de queratinocitos de rata.

Cuadro clínico. La cicatriz se ve fina y delicada. En algunos lugares se observan zonas descamadas y descamadas.

Imagen microscópica. El estrato córneo está engrosado, con hiperqueratosis en algunos lugares. La epidermis está engrosada y consta de 12 a 20 filas de células. El límite entre la epidermis y la dermis es una línea recta. Delicadas fibras de colágeno se encuentran bajo la epidermis, densamente distribuidas. En las capas más profundas de la cicatriz, se agrupan en haces gruesos y gruesos. En la capa subepidérmica, aparece una nueva formación vascular. En las capas inferiores del tejido cicatricial, se observan numerosos vasos sanguíneos vacíos, paralelos a la superficie de la epidermis. Grandes fibroblastos se distribuyen uniformemente en el espesor de la cicatriz, y se observan numerosos macrófagos gigantes, multiramificados.

Cicatriz de rata 5 meses después del trasplante de células epidérmicas de rata.

Cuadro clínico. La cicatriz se ve uniforme, lisa y sin descamación. Se observan cabellos sueltos, cuya densidad es mayor en la periferia de las cicatrices, lo que indica un crecimiento marginal de folículos pilosos en la cicatriz y su nueva formación. El área de las cicatrices continúa disminuyendo.

Imagen microscópica. La epidermis aún es gruesa (15-20 capas, en algunos lugares hasta 30). En las capas superiores, está llena de granos de queratohialina. La membrana basal es claramente visible. Bajo ella, las fibras de colágeno se encuentran laxas. En las capas inferiores, el colágeno es más fuerte y está más compacto. Hay muchos capilares entre los haces de colágeno. En las capas superiores, el número de vasos sanguíneos vacíos ha disminuido. La unión de la epidermis y la dermis es ligeramente ondulada. En algunos lugares, hay crecimientos epidérmicos profundos en el tejido cicatricial. Se observan vasos sanguíneos de nueva formación entre las fibras de colágeno. Aparecen folículos pilosos individuales y glándulas sebáceas.

Cicatriz de rata 9 meses después del trasplante de células MPA epidérmicas de rata.

Cuadro clínico. Las cicatrices se han reducido significativamente en comparación con periodos anteriores; su superficie es, en promedio, de 1,5 a 2,0 cm² ^. Las cicatrices están cubiertas de forma irregular por vello fino, especialmente en la periferia. Persiste una ligera descamación de las placas finas.

Imagen microscópica.

La epidermis se ha adelgazado, está representada por 6-8 filas de células y su estructura se asemeja a la de la piel de rata normal, con la diferencia de que la densidad celular es 1 mm mayor y son más pequeñas. La capa basal está compuesta por pequeñas células cilíndricas. La membrana basal está bien expresada y los hemidesmosomas son claramente visibles. Se observa la presencia de excrecencias epidérmicas en la capa subepidérmica. La capa papilar se extiende a lo largo de toda la cicatriz. Estos datos indican que, para entonces, la adhesión de los queratinocitos trasplantados con el tejido cicatricial subyacente se ha fortalecido considerablemente. Por lo tanto, el cuidado de las cicatrices en personas con trasplante de MPALK 9 meses después del trasplante de MPC puede ser tradicional. Bajo la epidermis, las fibras de colágeno son más delicadas que en las capas profundas. Han aparecido numerosos vasos, especialmente los superficiales. Las paredes de los vasos más grandes están engrosadas. Los folículos pilosos y las glándulas sebáceas se encuentran en gran cantidad. La imagen microscópica se asemeja a un tejido dérmico.

Resultados del trabajo experimental y su discusión.

En este trabajo, se trasplantaron queratinocitos en diversas formas a cicatrices de piel de rata creadas artificialmente tras una cirugía de dermoabrasión: sobre apósitos, como suspensión sobre batista y como una capa multicapa sin sustrato. El objetivo del trabajo fue obtener datos morfológicos sobre el efecto de los queratinocitos alogénicos trasplantados en las cicatrices, así como determinar las opciones óptimas de trasplante.

Se demostró que los tres métodos de trasplante son viables, pero el trasplante de la MPAC sin sustrato es un procedimiento muy laborioso, durante el cual la MPAC puede lesionarse, lo que afecta los resultados del trasplante. Además, este método de trasplante excluye el trabajo en grandes superficies.

El trasplante de suspensión de queratinocitos es un método mucho más rentable, no requiere un cultivo celular prolongado y es sencillo en la versión que proponemos, que utiliza blancos de batista estériles, cuyo tamaño se corresponde con el de las cicatrices. El retraso en el efecto terapéutico al trasplantar una suspensión celular, de aproximadamente un mes en comparación con el trasplante de MPC sobre una herida, no es un punto significativo con una duración del tratamiento de varios meses. Se sabe que cuando se trasplanta MPC a pacientes con quemaduras, la transformación de la estructura de la piel se produce de forma gradual y a lo largo de varios años. El trasplante de cultivo de queratinocitos sobre heridas es el método más conveniente y prometedor, pero también significativamente más costoso. Además, actualmente requiere la búsqueda de opciones de recubrimiento más avanzadas que sean flexibles, higroscópicas, con propiedades bacteriostáticas o bactericidas y biológicamente neutras para las células. La película "Polypor", una versión intermedia de la película doméstica para cubrir heridas, a pesar de algunas imperfecciones, nos permitió estudiar experimentalmente el trasplante de queratinocitos de rata sobre cicatrices y extraer conclusiones sobre la eficacia de esta línea de tratamiento de cicatrices.

Los autores que trasplantaron MPC en heridas por quemaduras observaron que, durante la primera semana tras el trasplante de una capa multicapa de queratinocitos en heridas desinfectadas, la epidermis se engrosó y estratificó. Todas las capas de la epidermis eran claramente visibles. Curiosamente, el número de capas celulares en los trasplantes fue entre un 10 % y un 30 % mayor que en las biopsias de piel. Los autores observaron la aparición de gránulos de queratohialina al quinto día tras el trasplante de MPC, y de la membrana basal y los hemidesmosomas, ya al tercer día.

J. Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) encontraron que en las primeras etapas después del trasplante de MPC a pacientes con defectos de piel de espesor completo después de quemaduras, la conexión entre la dermis y la epidermis es muy débil y es una línea recta, la capa papilar está ausente. Al final del segundo mes, las papilas superficiales y los apéndices cutáneos comienzan a formarse, la conexión entre la dermis y la epidermis se vuelve más fuerte. Los datos de la literatura indican que el trasplante de queratinocitos alogénicos en heridas en pacientes con quemaduras es un método prometedor. A pesar de que el rechazo de los queratinocitos alogénicos ocurre, según diferentes autores, dentro de los 10 días a los 3 meses, aún desempeñan su papel en la curación de la superficie de la herida, la secreción de factores de crecimiento y el cierre mecánico del defecto. Se cree que las células MPALC presentan una actividad antigénica reducida, ya que durante el cultivo in vitro pierden células de Langerhans, lo que les permite permanecer en el organismo del receptor durante un largo periodo. Además, un cultivo alogénico obtenido de la piel de personas jóvenes y sanas tiene un potencial biológico incomparablemente mayor que un cultivo autólogo de pacientes tras una lesión.

El objetivo principal de nuestro estudio fue determinar si los queratinocitos alogénicos se implantan en las cicatrices y qué cambios se producen en el tejido cicatricial bajo la influencia de este "recubrimiento de heridas" biológicamente activo. En caso de obtener un resultado positivo, desarrollar la tecnología más eficaz y menos laboriosa para esta área de la medicina de rehabilitación.

Los datos obtenidos fueron similares en muchos aspectos a los publicados sobre los cambios morfológicos que se producen en la epidermis humana tras el trasplante de queratinocitos alogénicos en heridas por quemaduras. Sin embargo, también existen diferencias significativas, tanto en el sustrato morfológico sobre el que se realiza el trasplante como en la tecnología empleada. Así, el proceso de formación de la membrana basal y las conexiones dermoepidérmicas (hemidesmosomas, papilas) ocurre en una etapa posterior en comparación con el trasplante de queratinocitos a superficies de heridas sin cambios cicatriciales. Aparentemente, esto se debe a la menor nutrición del tejido cicatricial en comparación con la dermis o la fascia muscular. Una cicatriz, especialmente una antigua, es un tejido conectivo denso con muy pocos vasos, mientras que el fondo de una quemadura es un tejido de granulación rico en vasos. Por lo tanto, es evidente que las condiciones en las que se producen el trasplante y el injerto de queratinocitos son completamente diferentes. Cuanto más vascularizada esté la zona de trasplante celular, más fácil será su injerto. De este postulado se desprende la conclusión sobre la preferencia por trabajar con cicatrices jóvenes, en las que el tejido conectivo aún es bastante laxo y rico en vasos.

Como resultado de este trabajo experimental se demostró que:

1. Es posible el trasplante de MPALK a cicatrices.
2. El método óptimo de trasplante es el trasplante de queratinocitos sobre el tejido de la herida.
3. La superficie de la cicatriz debe pulirse mediante dermoabrasión láser quirúrgica o un cortador Schumann.
4. Bajo la influencia de MPALK, se produce una rápida epitelización de la superficie pulida de la cicatriz.
5. Cuanto mejor vascularizado esté el tejido cicatricial, es decir, cuanto más joven sea la cicatriz, mejores serán los resultados del trasplante de queratinocitos.
6. Bajo la influencia de los queratinocitos trasplantados, el tejido cicatricial se transforma gradualmente y adquiere un aspecto dérmico (tejido cicatricial más suelto con apéndices de piel).
7. Distensión gradual del tejido cicatricial, comenzando por la capa subepidérmica. Su vascularización mejora y los haces de fibras de colágeno en las partes superior e inferior de la cicatriz adquieren una disposición más laxa que en el tejido cicatricial sin trasplante celular. Aparecen folículos pilosos y glándulas sebáceas. La epidermis, tras superar la fase de hipertrofia, se asemeja a la estructura de la piel normal.
8. Los cambios observados están asociados a factores de crecimiento y citocinas secretadas por los queratinocitos, que al mejorar el trofismo del tejido cicatricial, promueven su transformación de tejido fibroso grueso a tejido más laxo, lo que conduce a una mejora en el aspecto de la cicatriz.

Por tanto, en base a este estudio, se puede concluir que los queratinocitos trasplantados tienen un efecto beneficioso sobre el tejido cicatricial, lo que puede tener implicaciones prácticas para la rehabilitación de pacientes con diversos tipos de cicatrices.

Este trabajo en ratas también nos permitió formular los requisitos para los recubrimientos de heridas en los que se cultivan queratinocitos.

Los apósitos para heridas deben ser:

• biocompatible con las células,
• respirable,
• tienen una base elástica que moldea la forma,
• ser hidrófilo,
• Los aditivos medicinales contienen fármacos antibacterianos y antioxidantes que no son tóxicos para las células cultivadas.

Resultados clínicos del tratamiento biotecnológico de cicatrices.

Previamente, N. Carver et al. (1993) descubrieron que los apósitos oclusivos promueven mejor la adhesión a la herida y la supervivencia de los queratinocitos, pero impiden la formación de una epidermis estratificada (madura). Para la formación de esta epidermis estratificada es necesario un ambiente ventilado. Por lo tanto, tras la adhesión de una capa multicapa, se propuso retirar el apósito oclusivo tras 7-10 días y tratar las heridas con apósitos secos o ungüentos hidrosolubles. Cabe afirmar que la calidad y las propiedades del sustrato sobre el que se cultivan las células son fundamentales para la eficacia del trasplante celular y, por consiguiente, para los resultados del trabajo médico. Sin embargo, hoy en día no existe un apósito ideal para heridas, a pesar de la abundancia de opciones propuestas (piel artificial, tela no tejida de carboximetilcelulosa, recubrimientos de fibrina, películas de poliuretano semipermeables). Un punto importante en este asunto es el coste de los “sustratos” (coberturas especiales para heridas), ya que su elevado coste incrementa el coste global del tratamiento biotecnológico.

La eficacia de las tecnologías celulares ha sido demostrada hasta la fecha, pero, lamentablemente, estas tecnologías son muy costosas, especialmente en países donde no se ha establecido la producción industrial de composiciones celulares. No obstante, países como Estados Unidos cuentan desde hace tiempo con una industria dedicada a la producción de material celular para trasplantes de quemados. En particular, la empresa BioSurface Technology Inc., desde 1989, ha cultivado 37 000 capas multicapa de queratinocitos, que se utilizaron para tratar a 240 pacientes en 79 países de todo el mundo (R. Odessey, 1992), mientras que 1 cm² de cultivo ^celular cuesta entre 7 y 8 dólares estadounidenses.

La tecnología para tratar diversas enfermedades y problemas de la piel tiene varias diferencias, pero cualquier tratamiento celular se basa en la obtención de material celular de alta calidad y su trasplante.

Este proceso consta de los siguientes pasos:

• tomar piel de las víctimas (o de los donantes),
• transporte de colgajos de piel a un centro de biotecnología,
• aislamiento de células de la capa basal y su proliferación,
• crecimiento de capas de queratinocitos multicapa (MLK).
• trasplante de cultivo celular.

El principal problema al realizar un tratamiento mediante trasplante de láminas de queratinocitos multicapa es la necesidad de células viables en todas las etapas del trasplante celular. Los fragmentos de piel para aislar células autólogas o alogénicas deben ser lo más finos posible, ya que en este caso son más fáciles de separar mediante métodos mecánicos y enzimáticos y obtener una suspensión de células vivas para su cultivo. Estas pueden obtenerse mediante cortes con un dermatomo o utilizando la piel de los párpados, el prepucio y la cara interna del hombro. Dado que las células son sensibles a los halógenos (cloro, yodo) y al peróxido de hidrógeno, no pueden utilizarse durante el procesamiento de la piel durante la recolección de material.

El rendimiento cuantitativo y cualitativo de las células de los injertos de piel, así como la eficiencia de su cultivo, también dependen de la salud y la edad del donante. Además, las biopsias de piel deben entregarse lo antes posible y en condiciones adecuadas (ambiente, temperatura) a un laboratorio certificado y acreditado para estos fines.

Para el almacenamiento y transporte de colgajos de piel, se puede utilizar medio de Eagle o medio 199 con la adición de 10% de suero bovino, medio DMEM con la adición de 5% de suero bovino fetal y antibióticos.

En el laboratorio de citología, la biopsia de piel primero se divide mecánicamente en pequeños trozos, luego los trozos de piel se procesan utilizando enzimas: tripsina, colagenasa, dispasa, etc.

Bajo la acción de enzimas, los desmosomas se destruyen y los queratinocitos se liberan al medio en forma de células individuales o agregados que consisten en diferentes números de células. Solo se utilizan queratinocitos basales para el cultivo, que se cultivan en medios especiales en termostatos que contienen 5% de CO, en placas de Petri o en matraces a t = 37 °C. Ya después de 48 horas, se observa la formación de colonias de queratinocitos, que gradualmente se fusionan para convertirse en una monocapa. Después de recibir un número suficiente de células, la suspensión resultante se siembra en apósitos para heridas preparados para este propósito y se colocan en placas de Petri. Primero, se forma una monocapa y luego una capa multicapa de queratinocitos a partir de la suspensión. Las etapas del proceso de cultivo de queratinocitos se muestran esquemáticamente en la Fig. 12 (33, 43, 54, 65).

La formación de una capa multicapa de queratinocitos apta para el trasplante suele tardar entre 7 y 10 días. En ocasiones, este periodo es mayor, dependiendo de la calidad del material de partida (edad, estado de salud del donante, correcta recolección del material, calidad del medio utilizado, etc.). Si la capa multicapa crece excesivamente, pueden aparecer en su superficie células con fenómenos de apoptosis no aptas para el trasplante. Las placas de Petri con capas multicapa de queratinocitos (MLK) cultivadas sobre apósitos se entregan a la clínica en recipientes especiales a una temperatura mínima de +15 °C.

Método de Green modificado para el cultivo de MPC

En nuestro trabajo, utilizamos batista multicapa como recubrimiento para heridas, abandonando las películas "Polypor" con las que comenzamos a trabajar en el experimento con ratas. De este modo, cultivamos capas multicapa de queratinocitos sobre batista predesgrasada y estéril, aunque tampoco es un recubrimiento óptimo para heridas.

Los estudios clínicos se realizaron con voluntarios cumpliendo los estándares éticos necesarios: firma de un acuerdo y consentimiento informado.

1. Se utilizó un cultivo de queratinocitos del propio paciente (autólogos) y almacenados (alogénicos).
2. Los queratinocitos de los propios pacientes se obtuvieron de un trozo de piel cortado de la parte interior de la parte superior de sus brazos.
3. Se realizó cirugía de dermoabrasión de cicatrices utilizando termocauterio, discos rotatorios y láser de erbio.
4. Se tomaron grupos de pacientes con cicatrices normotróficas, hipotróficas e hipertróficas.

El proceso tecnológico para la aplicación de la tecnología celular para mejorar la apariencia de las cicatrices de la piel consistió en las siguientes etapas:

1. Selección de pacientes.
2. Explicación de la esencia del tratamiento, plazo de obtención de los resultados esperados, firma del contrato y consentimiento informado.
3. Prescribir a los pacientes 2-3 semanas antes de la cirugía selmevit 1 tableta 3 veces al día, zinctheral 1 tableta 3 veces al día.
4. Tomar un trozo de piel de 2,0 cm de largo y 0,7-1,0 cm de ancho de la superficie interna del hombro, a la altura, casi en la parte inferior de la región axilar para obtener queratinocitos autólogos.
5. En los casos en que los pacientes se negaron a aislar sus propios queratinocitos debido a la posibilidad de una cicatriz lineal en la superficie interna del hombro, se tomó material celular de un banco de células (queratinocitos alogénicos).
6. Los queratinocitos fueron aislados y cultivados en un laboratorio certificado para este tipo de trabajo.
7. Después de obtener una cantidad suficiente de MPC para trasplantar a las cicatrices, se fijó el día de la operación en la clínica, donde el material fue llevado en recipientes especiales en placas de Petri.
8. Se realizó una dermoabrasión de la cicatriz y hemostasia. La superficie pulida se lavó con solución salina estéril y se secó. Tras esto, se trasplantaron las células de la piel de la mandíbula (MPC) sobre una tela de batista estéril con la parte inferior de las células. Es decir, las células que se encontraban en la parte superior de las MPC se encontraron en la parte inferior, adyacentes a la superficie pulida.
9. Se aplicó una película estéril encima, que se fijó a la piel con una venda elástica o un apósito elástico Omnifix. En lugar de la película, se pueden utilizar apósitos de silicona, como Mepitel, Mepiform o láminas de gel de silicona.

Después de 5 a 7 días, se retira la película o el recubrimiento de silicona. Para entonces, todos los queratinocitos deberían haberse asentado sobre la cicatriz pulida y adherido a su superficie.

10. El ambiente húmedo creado bajo la película y el recubrimiento de silicona contribuye activamente a esto. La batista que queda en la cicatriz a partir de este momento puede impregnarse con curiosina o gel de quitosano. Como resultado, al segundo día se forma una costra densa que, para mayor comodidad del paciente, se fija mejor con un parche elástico y transpirable, como Omnifix. Esta costra transpirable permite que la epidermis formada se diferencie y madure.

Dependiendo del tipo de cicatriz y la profundidad del desgaste, el vendaje se desecha después de 8 a 10 días. En este momento, la epidermis tiene entre un 30 % y un 40 % más de capas celulares que la piel normal. La membrana basal no se forma. Los queratinocitos de la epidermis engrosada secretan numerosas moléculas biológicamente activas en el tejido cicatricial.

El éxito del tratamiento biotecnológico de cicatrices depende en gran medida del método de cuidado postoperatorio. Los cultivos celulares son un tipo de recubrimiento suave para heridas y, en las primeras etapas tras el trasplante, las células epiteliales in situ (CPI) se desprenden fácilmente de los tejidos subyacentes. Por lo tanto, se recomienda a los pacientes manipular la cicatriz con cuidado después de la cirugía. Durante 8-9 meses, no frote y trátela suavemente con agua hervida fría para evitar desgarrar la fina epidermis recién formada, que no mantiene una unión firme con los tejidos subyacentes.

Nota.

Antes de la cirugía y durante la dermoabrasión, se permite el uso de antisépticos y oxidantes halogenados (yodopirona, suliodopirona, yodinol, yodado, clorhexidina, peróxido de hidrógeno). Antes del trasplante celular, está estrictamente contraindicado debido a su efecto citotóxico. El azul de metileno y el verde brillante también son tóxicos para las células.

Para evitar infecciones, especialmente al trabajar con cicatrices hipertróficas, el campo quirúrgico puede tratarse con sulfato de neomicina, polimixina o gentamicina. No tienen efecto citotóxico sobre los queratinocitos.

Como resultado de este tratamiento se consigue un triple efecto.

1. Nivelación de la superficie de la cicatriz.
2. Creación de una capa de nueva epidermis de espesor normal encima.
3. Transformación de tejido cicatricial en tejido dérmico debido a la acción de citocinas, factores de crecimiento y otras moléculas biológicamente activas secretadas por las células trasplantadas y estimuladas por ellas (queratinocitos, fibroblastos y macrófagos).

La cicatriz se hace menos visible, más elástica, aparecen en ella poros y vello y se puede restaurar la pigmentación gracias a la presencia de melanocitos en el IPC.

Sin embargo, todos estos aspectos positivos de la cicatriz no se manifiestan de inmediato. En este sentido, es necesario advertir a los pacientes que el proceso de transformación del tejido cicatricial en tejido dérmico es lento y que el resultado óptimo de dicho tratamiento no puede esperarse antes de 10 a 14 meses. Inmediatamente después de retirar los apósitos, las superficies pulidas presentan una policromía pronunciada, tanto más brillante cuanto más profundo sea el pulido. El menor daño a la piel se observa al pulir cicatrices normotróficas con láser de erbio. El color de las cicatrices y la piel circundante se restableció en un plazo de 3 a 8 semanas. A pesar de estas precauciones, a veces se produce hiperpigmentación postoperatoria, que puede desaparecer por sí sola en pocos meses.

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