Trabajo experimental sobre el trasplante de queratinocitos alogénicos sobre cicatrices de ratas blancas creadas artificialmente

El deseo de utilizar el potencial celular y la necesidad de buscar nuevos métodos efectivos para mejorar la apariencia estética de las cicatrices condujo a la idea de tratar de estudiar la posibilidad del trasplante de queratinocitos en las superficies con cicatrices.

Con el fin de demostrar la posibilidad de utilizar cultivo de queratinocitos para mejorar la apariencia de las cicatrices del trabajo experimental se ha realizado sobre ratas blancas de laboratorio, que fueron creados superficie de la cicatriz. El modelo de rumen de las ratas se obtuvo como resultado de la curación de heridas infligidas artificialmente en la espalda, a lo largo de la columna vertebral. Las ratas se cortaron piezas de la misma piel, el tamaño de 2x3 cm. Después de 2,5 meses después de la operación las ratas "cicatrización de simulación" se llevó a cabo la cirugía dermoabrasión (eliminación de las capas superiores a través de rumen ignioperation) y queratinocitos alogénicos trasplantados, aislado a partir de piel de ratas jóvenes 2-4 días después del nacimiento.

El aislamiento y crecimiento de los epidermocitos se llevó a cabo en el laboratorio de tecnologías celulares del Instituto de Citología RAS de la siguiente tecnología.

La piel se lavó en solución salina de Hank que contiene 200 U / ml de gentamicina, cortado en trozos pequeños, un área de 0,2-0,5 cm ². Los cubos de la piel se incubaron en una solución al 0,5% de disaspasa en una solución salina tamponada con fosfato salina a 37 ° C durante una hora. Las piezas se transfirieron a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco y la epidermis se separó de la dermis. La epidermis se incubó en una solución de tripsina al 0,125% durante 10-15 minutos con agitación a 50 rpm, después de lo cual la acción de la enzima se detuvo mediante la adición de 5% de suero bovino fetal. Un tercio de la suspensión celular obtenida se usó en su forma pura para una de las variantes de trasplante en cicatrices, el segundo tercio se cultivó en revestimientos de película domésticos biocompatibles "Polypor", el tercero en placas de Petri sin sustrato. La operación de la dermoabrasión de las cicatrices obtenidas en ratas con posterior trasplante de epidermocitos de rata sobre ellas se llevó a cabo bajo anestesia con éter usando un cauterio de calor.

El primer grupo de ratas después de la dermoabrasión en pulido, se lavaron con solución salina y de superficie seca rumen estériles superponen trozos de césped, que se depositó revueltos suspensión rata alogénico epidermotsitov a una concentración de 1,5 millones de células por 1 ml (de acuerdo con el Instituto de Citología). Las piezas de Batistovye se ajustan a la cicatriz pulida para que las células se encuentren en la superficie de la cicatriz. Un vendaje de varias capas de gasa fue cosido en la parte superior, que fue cosido a los bordes de la cicatriz.

Parte de la suspensión celular resultante se sembró en placas de Petri sobre películas de Polypore estériles cortadas en forma de copas, la otra parte sobre placas de Petri sin película. El cultivo se llevó a cabo en un medio FAD que consistía en una mezcla de DMEM y F12 en una proporción de 3: 1. Con la adición de 10% de suero bovino fetal, 5 μg / ml de insulina (Sigma), 0,5 μg / ml de hidrocortisona hemisuccinato (Sigma). 10 μg / ml de factor de crecimiento epidérmico EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). El segundo y tercer grupo de ratas con 7 individuos fueron operados 6 días después del primero. En este momento, se formaron estratos multicapa a partir de la suspensión de queratinocitos sembrados en placas de Petri, que se trasplantaron a ratas. El segundo grupo fue trasplantado con epidermocitos en la película, el tercer grupo - con una capa de múltiples capas sin sustrato. Después de 7 días, las capas de capas múltiples de queratinocitos alógenos (MPALK), sembradas en películas Polypore, se trasplantaron por cultivo directamente sobre la superficie de la herida. Arriba, la película, para evitar su rasgadura, se fijó con un vendaje de gasa multicapa y se cosió a la piel de las ratas.

Antes del transplante queratinocitos tercer grupo de ratas, crecido sin el sustrato, produciendo una separación de PAC de la parte inferior del tratamiento plato dispasa Petri, que tiene la capacidad de romper selectivamente la comunicación dermo-epidérmica. Bajo la acción de una dispasa depósito de varias capas destruye la conexión de la capa de células basales de la parte inferior de la placa de Petri y en un grado mucho menor, afecta a la comunicación intercelular, que hace que sea posible "eliminar" toda la capa. El desprendimiento del estrato celular de capas múltiples por la disposición se llevó a cabo de la siguiente manera. De placas de Petri mezclaron medio de transporte, las láminas de células se lavaron tres veces con antibióticos medio que contiene, en particular, - la gentamicina (0,2 mg / ml). Capas de múltiples capas se vertieron 0.125% de solución de dispasa ( «Sigma») y se colocaron en una incubadora en la que se incubaron a t = 37 ° C durante 20-30 minutos. La aparición de corola blanca, descamación alrededor de la periferia del depósito - un indicador del comienzo del proceso de que lo separa de los bordes y la parte inferior de la placa de Petri. Unos minutos después del comienzo del proceso de separación, la solución del desfasaje se fusionó, las capas epiteliales se lavaron 2-3 veces con medio. En se aplicó la superficie de la capa epidérmica, cortado a tamaño de la pieza taza herida estéril vestir "Leith-color, que se escinde separó dispasa formación, más delaminación de la parte inferior de la taza con una espátula. Con ayuda de pinzas oftálmicas capa junto con el revestimiento de la compresa" Leith color "(en ruso ) se separó de la parte inferior de una placa de Petri y se transfirió cuidadosamente a la superficie preparada de la cicatriz. Servilletas "Lita color" contiene en su composición y eksolin gentamicina (extracto de colágeno), que cuando el ambiente húmedo permanece brote en el futuro solución salina Sem se hinchó y se convirtió en moderno recubrimiento herida que proporciona una buena protección contra la infección externa y la curación rápida debido a la humedad incipiente con la estructura.

Las películas de polipropileno y las servilletas de color lita se cubrieron con vendas de gasa que se cosían en la piel de las ratas para una fijación más duradera. Cada rata se plantó en una jaula separada, para crear las condiciones óptimas para su mantenimiento y el injerto de los queratinocitos trasplantados. Vendajes ratas que trasplantan suspensión y de múltiples capas reservorio epidermotsitov disparo dispasa, cada día varias veces al día, humedecidos con solución salina estéril para crear las condiciones más favorables que las células para el injerto. Teniendo en cuenta que la película "Polypor" era impermeable al agua, las ratas del segundo grupo no humedecieron los apósitos, que era una de las ventajas sobre los trasplantes sin película. Después de 10 días, se quitaron los vendajes. El cuadro clínico de las cicatrices después del trasplante celular difirió poco de las cicatrices sin trasplante, a excepción de una coloración más rosa (debido a la dermoabrasión) y una mayor descamación. Este hecho sugiere que. Que inmediatamente después de la desaparición de los recubrimientos de la herida con IPC, no se produjeron cambios en el rumen.

Tomando material de biopsia en ratas.

Después de 1, 2, 5 y 9 meses después de la transferencia de queratinocitos alogicos de rata a las cicatrices de suelo de ratas blancas, el material se tomó para examen histológico, citomorfológico y de microscopía electrónica. Como control se tomaron muestras de piel y cicatriz normales de ratas sin trasplante de células. La anestesia en ratas se realizó con anestesia con éter.

Después de la anestesia, desde las áreas marcadas, en las que se transplantaron los queratinocitos, se utilizó un perforador de biopsia con un diámetro de 2 mm. Los trozos de tejido cicatricial se tomaron y se colocaron en una solución de glutaraldehído al 2,5% para preparar el material para el microscopio electrónico. Los trozos de tejido tomados para el examen histológico se colocaron en una solución al 10% de formalina neutra, seguido de cableado a través de espíritus y vertido en parafina, seguido de corte de secciones ultradelgadas y su visualización en microscopios ópticos de luz.

Control I. Piel normal de rata.

Para poder ver la diferencia entre la imagen microscópica de la piel normal con cicatrices de ratas y cicatrices en ciertos momentos después del trasplante de CIP, se muestran fotografías y descripciones en todas las etapas de este estudio.

La epidermis de la piel normal consiste en 7-9 capas de células. Capa córnea de espesor moderado. En algunos lugares, consta de 6-8 capas de escamas córneas. La capa basal está representada por células de forma cilíndrica con gran luz, núcleos regulares y varios nucléolos. Las conexiones desmosomales entre las células y la membrana basal se expresan claramente. Bajo una membrana basal bien marcada, que tiene pequeñas excrecencias en la capa subepidérmica, paralela a ella se encuentran delicados haces de fibras de colágeno y elastina, entre los que se encuentra una forma alargada de fibroblastos, pequeños vasos. En capas más profundas, los haces de fibras de colágeno y elastina se encuentran en diferentes direcciones. Entre ellos hay muchos vasos con paredes delgadas del mismo calibre, elementos celulares (fibroblastos, mastocitos, leucocitos). En una gran cantidad de folículos capilares, glándulas sebáceas.

Control 2. Cicatriz de una rata de 2 meses de edad.

Cuadro clínico Cicatrices de color rosa pálido, con descamación, en los lugares donde permanecen las cortezas. Su área se disminuye debido a la contracción de las fibras de colágeno y se convierten en aproximadamente 3,0-3,5 cm ^:. Los archivos adjuntos de la piel están ausentes.

Imagen microscópica. La epidermis consta de 3-5 capas de células, plegadas, representadas por células basales de forma redondeada, una fila de subulate, 1-2 filas de granos granulares con queratogialina en la capa superior, hay secciones de edema intracelular. La capa corneal se cambia heterogéneamente de muy delgada a engrosada. Hay un plegamiento del rumen debido a (contracción) de tejido cicatricial. Los pliegues penetran en la capa papilar y dan la impresión de papilas. El límite entre la epidermis y la dermis es una línea recta. La membrana basal no se puede rastrear en todas partes. En la parte inferior de las capas subepidérmicas y más profundas, vasos con una pared gruesa y suelta, muchos desiertos, con fenómenos de estasis. Alrededor de los vasos: un grupo de macrófagos, fibroblastos. Los macrófagos rodean a los eritrocitos que salen de los capilares y los fagocitan. En las capas más superficiales - capilares pequeños. Debajo de la epidermis, las fibras de colágeno están sueltas. En la capa más profunda del rumen, haces ásperos de fibras de colágeno entre los que se encuentran muchos fibroblastos.

Cicatrización de una rata un mes después del trasplante de queratinocitos de rata de rata MPAl.

Cuadro clínico Las cicatrices son rosadas, su área disminuida, especialmente en diámetro y promedia 2.5-3 cm ². El cabello y las glándulas sebáceas están ausentes.

Estos examen microscópico del material obtenido de ratas con MPAlK transferencia MPAlK en la película y el sustrato sin sustancialmente idénticas. Sin embargo, técnicamente, el trabajo con MPAlK no soportado mucho más difícil y laborioso que cuando se cultiva MPAlK sobre el sustrato, por lo que el estudio adicional de la cuestión sobre el trasplante kertainotsitov cicatrices se utilizó como base para el cultivo ( "sustrato") de césped en capas.

Imagen microscópica. Hay un engrosamiento de la epidermis a 15-20 capas, casi en el medio de los cuales los queratinocitos tienen una forma estrecha, alargada, vertical y una disposición compacta. Las células basales están dispuestas en una línea desigual. Sus núcleos son ligeros, grandes, de forma redonda con uno o dos nucleolos, lo que indica su alta actividad sintética y proliferativa. El límite entre la epidermis y la dermis es una línea recta. La capa espinosa está bien desarrollada, consta de 3-5 capas de células de forma redonda, hay 2 células nucleolo.

Inmediatamente debajo de la membrana basal, haces finos densamente colocados de fibras de colágeno, en paralelo a ellos una gran cantidad de vasos vacíos, las fibras de colágeno más profundas son más gruesas y se recogen en haces densos. Muchos fibroblastos grandes, células cebadas (2-3 en el campo de visión), macrófagos, leucocitos y vasos vacíos, cuyas paredes se aflojan, alrededor de ellos se encuentran fibras de colágeno ubicadas libremente. En algunos vasos - estasis, diapedesis de elementos uniformes. Alrededor de los vasos: fibroblastos, linfocitos únicos. Los archivos adjuntos de la piel están ausentes.

Cuando una suspensión de queratinocitos se trasplanta a una cicatriz pulida, la imagen microscópica difiere de la anterior. En la mayoría de los animales, la epidermis es delgada, consta de 5-6 capas de células. La capa inferior consiste en células de forma irregular y poligonal con núcleos redondeados de forma irregular. La condición de la capa subepidérmica es similar a la del grupo de animales sin trasplante.

En este caso, se puede hablar de retraso en los procesos que acompañan al trasplante celular o de una gran pérdida de células trasplantadas en forma de suspensión. Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que la corrección de la cicatrización mediante el trasplante de queratinocitos en forma de suspensión es inapropiada.

Cicatrización de la rata 2 meses después del trasplante de queratinocitos de rata de rata MPAl.

Cuadro clínico La cicatriz se ve delgada, tierna. En lugares hay una ecdisis, escalas.

Imágenes microscópicas El estrato córneo está engrosado, en algunos lugares: hiperqueratosis. La epidermis está engrosada, consta de 12-20 filas de células. El límite entre la epidermis y la dermis es una línea recta. Las delicadas fibras de colágeno debajo de la epidermis yacen bastante apretadas. En capas más profundas del rumen se recolectan en grandes paquetes gruesos. En la capa subepidérmica, aparece una nueva formación de vasos. En las capas inferiores del tejido cicatricial, muchos vasos vacíos, ubicados paralelos a la superficie de la epidermis. Los grandes fibroblastos están distribuidos uniformemente en el espesor del rumen, hay macrófagos gigantes, multifacéticos y numerosos.

Cicatrización de la rata 5 meses después del trasplante del MP de espermatocitos de rata.

Cuadro clínico La cicatriz se ve lisa, lisa sin pelarse, hay pelos individuales, su densidad es mayor en la periferia de las cicatrices, lo que indica el crecimiento marginal de los folículos capilares en la cicatriz y la formación de folículos capilares. El área de las cicatrices continúa disminuyendo.

Imagen microscópica. La epidermis sigue siendo gruesa (15-20 capas, a veces hasta 30) en las capas superiores y está llena de granos de queratogialina. La membrana basal es claramente visible. Debajo de sus fibras de colágeno se encuentran sueltas. En las capas inferiores, el colágeno es más potente y está más compacto. Entre los haces de colágeno hay muchos capilares. En las capas superiores disminuyó el número de vasos vacíos. La epidermis y la dermis son ligeramente onduladas. Hay profundas excrecencias epidérmicas en el tejido cicatricial. Entre las fibras de colágeno son visibles los vasos recién formados. Aparecen folículos pilosos individuales y glándulas sebáceas.

Cicatrización de la rata 9 meses después del trasplante de epidermocitos de rata con rata IPA.

Cuadro clínico Las cicatrices se hicieron mucho más pequeñas en comparación con los términos anteriores, sus promedios de área de alrededor de 1.5-2.0 cm ². Las cicatrices están cubiertas irregularmente con cabello fino, especialmente alrededor de la periferia. Se mantiene la escala menor de placa pequeña.

Imagen microscópica.

La epidermis se volvió más delgada, representada por 6-8 filas de células, que recuerda la estructura epidérmica de la piel normal de las ratas, solo la densidad de las células por 1 mm. Más alto y son más pequeños. La capa basal consiste en pequeñas células de forma redonda cilíndrica. La membrana basal está bien definida, los hemidesmosomas son claramente visibles. Se observa la presencia de excrecencias epidérmicas en la capa subepidérmica. La capa papilar se expresa a lo largo de toda la cicatriz. Estos hechos muestran que durante este período de tiempo la adhesión de los queratinocitos trasplantados se ha vuelto significativamente más fuerte con los tejidos subyacentes del rumen. En consecuencia, el cuidado de las cicatrices de las personas con trasplante de MALC 9 meses después del trasplante de CIP puede ser tradicional. Debajo de la epidermis hay fibras de colágeno más delicadas que en las capas profundas. Hubo muchos buques, especialmente ubicados en forma superficial. En vasos más grandes, las paredes están engrosadas. Folículos pilosos y glándulas sebáceas en grandes cantidades. El patrón microscópico se asemeja a un tejido dérmico.

Resultados del trabajo experimental y su discusión.

En el transcurso de este trabajo, los queratinocitos fueron trasplantados en diferentes formas en cicatrices cutáneas creadas artificialmente de ratas, después de la operación de dermoabrasión, en recubrimientos de heridas, como una suspensión en la batista y una capa de múltiples capas sin sustrato. El trabajo se realizó para obtener datos morfológicos sobre el efecto de los queratinocitos alogénicos trasplantados en las cicatrices, así como para determinar las variantes óptimas de trasplante.

Se descubrió que los tres métodos de trasplante son reales, pero el trasplante de IPAA sin sustrato es un procedimiento muy laborioso, durante el cual se puede dañar el IPAC, lo que afecta los resultados del trasplante. Además, este método de trasplante excluye el trabajo en superficies grandes.

El trasplante de la suspensión de queratinocitos es un método mucho más económico, no requiere un cultivo celular prolongado, y es simple en nuestra versión propuesta utilizar tochos de batista estériles cuyas dimensiones corresponden al tamaño de las cicatrices. El retraso del efecto terapéutico durante el trasplante de la suspensión celular durante aproximadamente un mes en comparación con la CIM en el revestimiento de la herida no es un momento significativo con la duración del tratamiento, calculado en muchos meses. Se sabe que durante el trasplante de CIP a pacientes quemados, la transformación del estado de la estructura de la piel se produjo gradualmente y durante varios años. El trasplante del cultivo de queratinocitos en el recubrimiento de heridas es el método más conveniente y prometedor, sin embargo, también es mucho más costoso. Además, requiere para hoy la búsqueda de recubrimientos más sofisticados que deban ser plásticos, higroscópicos, tengan propiedades bacteriostáticas o bactericidas y sean biológicamente neutros para las células. La película de Polypore, una variante intermedia del recubrimiento doméstico de la película, a pesar de alguna imperfección, nos permitió estudiar en el experimento un trasplante de queratinocitos de ratas en cicatrices y sacar conclusiones sobre la efectividad de esta dirección en la cicatrización de cicatrices.

Los autores que realizaron el trasplante de IPC en heridas quemadas notaron que durante la primera semana después del trasplante de la capa de queratinocitos de varias capas sobre las heridas desinfectadas, la epidermis se espesó y se estratificó. Todas las capas de la epidermis estaban bien definidas. Es interesante que el número de capas de células en los trasplantes es 10-30% mayor que en las muestras de biopsias de piel. Los autores notaron la aparición de gránulos de queratogialina en el quinto día después del trasplante de MPA, la membrana basal y los hemidesmosomas, ya en el tercer día.

J.Rives y otros (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) encontraron que durante los primeros períodos siguientes de trasplante de pacientes de DMO con defectos de la piel polnosloynymi después de quemaduras, la comunicación entre la dermis y la epidermis es muy débil y es una línea recta, capa papilar está ausente. Al final del segundo mes comienza la formación de papilas poco profundo y apéndices de la piel, la dermis y la epidermis de comunicación se vuelve más fuerte. Los datos de la literatura hablan del trasplante de queratinocitos alogénicos en las heridas de los pacientes quemados, como un método prometedor. A pesar de que el rechazo de los queratinocitos alogénicos se produce presentada por varios autores en el plazo de 10 días a 3 meses, sin embargo, tienen un papel en la cicatrización de la superficie de la herida, la liberación de factores de crecimiento y cerrar mecánicamente el defecto. Se cree que MPAlK han reducido la actividad antigénica, como cuando se cultivan in vitro pierden células de Langerhans que les permite existen desde hace mucho tiempo en el cuerpo del receptor. Además, el cultivo alogénico obtenido de la piel de personas sanas jóvenes tiene un potencial biológico incomparablemente mayor que el cultivo autólogo de pacientes después de un trauma.

El objetivo principal de nuestro estudio fue averiguar si los queratinocitos alogénicos sobrevivirán en las cicatrices y cuáles serán los cambios en el tejido cicatricial bajo la influencia de dicho "recubrimiento de heridas" biológicamente activo. En caso de un resultado positivo, elabore la tecnología más efectiva y menos intensiva en esta área de medicina de rehabilitación.

Los datos obtenidos por nosotros en muchos aspectos resultaron ser similares a los datos de la literatura sobre los cambios morfológicos que ocurren en la epidermis humana después de la transferencia de queratinocitos alogénicos para quemar heridas. Pero existen diferencias significativas, tanto en términos del sustrato morfológico, que se trasplanta, como en términos de tecnología. Entonces el proceso de formación de la membrana basal y las conexiones dermoepidérmicas (hemidesmosomas, papilas) ocurre más adelante que en el trasplante de queratinocitos a las superficies de la herida sin cambios en la cicatriz. Esto parece deberse a la mala nutrición de los tejidos del rumen en comparación con la dermis o la fascia muscular. La cicatriz, especialmente la anterior, es un tejido conectivo denso con un número muy pequeño de vasos, la parte inferior de la quemadura es un tejido de granulación rico en vasos sanguíneos. Por lo tanto, es obvio que las condiciones bajo las cuales se producen el trasplante y el injerto de queratinocitos son completamente diferentes. Cuanto más vascularizado esté el área de trasplante de células, más fácil será procesarlas. A partir de este postulado, se llega a una conclusión acerca de la preferencia por trabajar con cicatrices jóvenes, en las cuales el tejido conectivo aún está lo suficientemente suelto y rico en vasos sanguíneos.

Como resultado de este trabajo experimental, se demuestra que:

1. Es posible un trasplante de MALK a las cicatrices. 
2. El método óptimo de trasplante es el trasplante de queratinocitos en la cubierta de la herida.
3. La superficie de la cicatriz debe molerse usando una dermoabrasión quirúrgica usando el láser de Schumann o un cortador.
4. Bajo la influencia de MPALK, ocurre una rápida epitelización de la superficie del rumen en el suelo.
5. El tejido cicatricial mejor vascularizado, es decir, cuanto más joven es la cicatriz, mejores son los resultados del trasplante de queratinocitos.
6. El tejido cicatricial bajo la influencia de los queratinocitos trasplantados se transforma gradualmente y se convierte en un tejido cicatricial más friable con apéndices de la piel.
7. El aflojamiento gradual del tejido cicatricial comienza con la capa subepidérmica. Mejora su vascularización, los haces de fibras de colágeno en la parte superior e inferior del rumen toman una ubicación más friable que en el tejido cicatrizal sin trasplante de células. Hay folículos pilosos y glándulas sebáceas. La epidermis en su estructura, después de pasar la fase de hipertrofia, se acerca a la epidermis de la piel normal.
8. Los cambios observados están asociados con factores de crecimiento derivados de queratinocitos, las citocinas, que mejoran el trofismo del tejido cicatricial y facilitan su transformación del tejido fibroso grueso en un tejido más friable, lo que conduce a una mejora en la apariencia de la cicatriz.

Por lo tanto, en base a este estudio, se puede concluir que el efecto beneficioso de los queratinocitos trasplantados en el tejido cicatricial, que puede ser de importancia práctica para la rehabilitación de pacientes con diversos tipos de cicatrices.

Este trabajo en ratas también permitió formular requisitos. Para los recubrimientos de las heridas, sobre los cuales crecen los queratinocitos.

Los recubrimientos de heridas deben ser:

• biocompatible con células,
• transpirable,
• tener una base elástica que forme la forma,
• ser hidrofílico,
• ya que los aditivos medicinales contienen medicamentos antibacterianos y los antioxidantes no son tóxicos para las células cultivadas.

Resultados clínicos del tratamiento biotecnológico de cicatrices.

Anteriormente, N. Carver et al. (1993) encontraron que los vendajes oclusivos son mejores para adherirse a la herida y la supervivencia de los queratinocitos, pero no permiten la formación de una epidermis estratificada (madura). Para formar epidermis estratificada, es necesario un ambiente de aire. Por lo tanto, después de unir la capa multicapa, se sugirió una cobertura de herida oclusiva después de 7-10 para eliminar y conducir heridas bajo vendajes secos o ungüentos solubles en agua. Podemos decir que la calidad y las propiedades del "sustrato" en el que se cultivan las células son muy importantes para la eficacia del trasplante del material celular y, en consecuencia, para los resultados del trabajo de los médicos. Pero hoy en día no existe una herida ideal, a pesar de la abundancia de las opciones propuestas (cuero artificial, tela no tejida de carboximetilcelulosa, recubrimientos de fibrina, películas de poliuretano semipermeables). Un momento no importante en este asunto es el costo de los "sustratos" (recubrimientos especiales para heridas), ya que su alto costo aumenta el costo total del tratamiento biotecnológico.

La eficacia de las tecnologías celulares se ha demostrado hasta la fecha, pero, desafortunadamente, estas tecnologías son muy costosas, especialmente en países donde la producción industrial de composiciones celulares no está establecida. Sin embargo, países como los Estados Unidos han establecido desde hace tiempo una industria para la producción de material celular para el trasplante de quemados. En particular, BioSurface Technology Inc, desde 1989, ha cultivado 37,000 estratos de queratinocitos de múltiples capas que se han utilizado para tratar 240 pacientes en 79 países (R.Odessey, 1992) con 1 cm ^{2 de} cultivo celular que cuesta alrededor de 7-8 $ US.

La tecnología para tratar diversas enfermedades y problemas de la piel tiene varias diferencias, pero en el corazón de cualquier tratamiento con células está la producción de material celular de calidad y su trasplante.

Este proceso consta de los siguientes pasos:

• selección de piel del afectado (o de donantes),
• transporte de colgajos de piel al centro de biotecnología,
• el aislamiento de las células de la capa basal y su multiplicación,
• acumulación de capas de capas de queratinocitos (IPC).
• trasplante de cultivos celulares.

El principal problema en el tratamiento con el trasplante de estratos de queratinocitos de múltiples capas es la necesidad de células viables en todas las etapas del trasplante de células. Las piezas de piel para aislar células autólogas o alogénicas deben ser lo más delgadas posible, ya que en este caso son más fáciles de separar utilizando métodos mecánicos y enzimáticos y para obtener una suspensión de células vivas para el crecimiento. Se pueden obtener cortando el dermatoma o usando la piel de los párpados, el prepucio y la superficie interna del hombro. Dado que las células son sensibles a los halógenos (cloro, yodo), peróxido de hidrógeno, no se pueden utilizar en el tratamiento de la piel en el momento de tomar el material.

El rendimiento cuantitativo y cualitativo de las células procedentes de injertos de piel y la eficacia de su cultivo también dependen del estado de salud y la edad del donante. Además, las muestras de biopsia de piel deben enviarse al laboratorio lo antes posible y en las condiciones apropiadas (ambiente, temperatura) entregadas a un laboratorio certificado y acreditado.

Eagle medio o medio 199 con la adición de suero bovino al 10%, medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 5% y antibióticos se pueden utilizar para almacenar y transportar colgajos de piel.

En el laboratorio citológico, la biopsia cutánea se divide mecánicamente en pequeños trozos, luego el procesamiento de los fragmentos de la piel se lleva a cabo con la ayuda de enzimas: tripsina, colagenasa, dispasa, etc.

Bajo la acción de las enzimas, se produce la destrucción por desmosomas y los queratinocitos se liberan en el medio como células separadas o agregados que consisten en diferentes números de células. Para el cultivo, solo se usan queratinocitos basales que se cultivan en medios especiales en incubadoras que contienen 5% de CO., En placas de Petri o en viales a t = 37ºC. Dentro de las 48 horas, se observa la formación de colonias de queratinocitos, que gradualmente convergen en una monocapa. Después de obtener un número suficiente de células, la suspensión resultante se extiende sobre las cubiertas de heridas preparadas para este propósito y se colocan en placas de Petri. A partir de la suspensión, primero se forma una monocapa y luego se forma una capa de queratinocitos de múltiples capas. Esquemáticamente, las etapas del proceso de cultivo de queratinocitos se muestran en la Fig. 12 (33.43.54.65).

La formación de una formación de queratinocitos multicapa adecuada para el trasplante generalmente dura de 7 a 10 días. A veces este período es más largo, lo que depende de la calidad del material de origen (edad, salud del donante, la corrección del material, la calidad de los medios utilizados, etc.). Si la capa de varias capas crece demasiado, entonces en su superficie puede haber células con fenómenos de apoptosis no aptos para el trasplante. Las cápsulas de Petri, que crecen en ellos sobre recubrimientos de heridas mediante capas de queratinocitos de múltiples capas (IPC), se envían a la clínica en recipientes especiales a una temperatura no inferior a + 15ºC.

El método Green modificado para hacer crecer el IPC

En nuestro trabajo como revestimiento de heridas, utilizamos una batista de varias capas, abandonando las películas de polypore con las que comenzamos a trabajar en un experimento con ratas. Por lo tanto, los estratos de queratinocitos de múltiples capas fueron cultivados por nosotros en la pre y la esterilización de la batista, aunque tampoco es la cobertura óptima de la herida.

Se realizaron estudios clínicos en voluntarios con observancia de las normas éticas necesarias: la firma de un tratado y el consentimiento informado.

1. Se aplicó el cultivo propio (autólogo) y tomado de los queratinocitos (alogénicos) de células del banco.
2. Los queratinocitos propios se obtuvieron a partir de un corte de piel del interior del hombro de los pacientes.
3. La operación de la dermoabrasión de las cicatrices se llevó a cabo con la ayuda de un termoacoplamiento, discos rotatorios y láser de erbio.
4. Se tomaron grupos de pacientes con cicatrices normotróficas, hipotróficas e hipertróficas.

El proceso tecnológico para la aplicación de la tecnología celular para mejorar el tipo de cicatrices de la piel consistió en las siguientes etapas:

1. Selección de pacientes
2. Explicar la esencia del tratamiento, el momento de obtener los resultados esperados, la firma de un tratado y el consentimiento informado.
3. Nombramiento de pacientes por 2-3 semanas antes de la cirugía selmevit por 1 t. 3 veces al día, zinkteral en 1t. 3 veces al día.
4. Tomar un pedazo de piel de 2.0 cm de largo y 0.7-1.0 cm de ancho desde la superficie interna del hombro, alto, casi en la parte inferior de la región axilar, para obtener queratinocitos autólogos.
5. En el caso de pacientes que se niegan a aislar sus propios queratinocitos debido a la posibilidad de obtener una cicatriz lineal en la superficie interna del hombro, el material celular se tomó de un banco de células (queratinocitos alogénicos).
6. Los queratinocitos se aislaron y cultivaron en condiciones de un laboratorio certificado para este tipo de trabajo.
7. Después de recibir un IPC suficiente para el trasplante, se administró un día de cirugía a las cicatrices en la clínica, donde se trajo el material en contenedores especiales en placas de Petri.
8. Se llevó a cabo la operación de dermoabrasión del rumen, hemostasia, se lavó la superficie del suelo con solución salina estéril, se secó, después de lo cual se trasplantó el IPC sobre células de batiste estéril hacia abajo. Es decir, las celdas que estaban en la parte superior de la MIC eran más bajas, adyacentes a la superficie pulida.
9. Se superpuso una película estéril en la parte superior, que se fijó a la piel con un vendaje elástico o banda elástica Omnifix. En lugar de la película, también se pueden usar revestimientos de heridas indiferentes que contienen silicona, por ejemplo Mepitel, Mepiform, placas de gel de silicona.

Después de 5-7 días, se retira la película o el recubrimiento de silicona. En este momento, todos los queratinocitos tienen que arrastrarse hasta la cicatriz pulida y adherirse a su superficie.

10. El ambiente húmedo creado bajo la película y el revestimiento de silicona está contribuyendo activamente a esto. El bautista que permanece en la cicatriz desde este punto puede estar impregnado con curioses o gel de quitosano. Como resultado, en el segundo día, se crea una costra densa que, para comodidad del paciente, es mejor fijarla con un yeso elástico, permeable al aire, por ejemplo Omnifix. La corteza transpirable permite que la epidermis recién formada se diferencie y se convierta en una madura.

Dependiendo del tipo de cicatriz y la profundidad de la molienda, el vendaje se rechaza después de 8-10 días. La epidermis en este momento tiene un 30-40% más de capas celulares que en la piel normal. La membrana basal no está formada. Los queratinocitos de la epidermis engrosada liberan una masa de moléculas biológicamente activas en el tejido cicatricial.

El éxito del tratamiento biotecnológico de las cicatrices depende en gran medida de la forma en que se cuiden en el período postoperatorio. Los cultivos celulares son un tipo de cobertura de heridas "tierna" y en los períodos iniciales después del trasplante, la DMO se puede desprender fácilmente de los tejidos subyacentes. Por lo tanto, se aconseja a los pacientes que cuiden la cicatriz después de la cirugía. Durante 8-9 meses, no frote y trabaje fácilmente con agua hervida fría para evitar arrancar una epidermis fina y recién creada que no tiene un agarre firme con los tejidos subyacentes.

Nota:

Antes de la cirugía y durante el uso dermoabrasión de oxidantes halogenados y conservantes (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, clorhexidina, peróxido de hidrógeno) es permisible antes de trasplantar kletok- absolutamente contraindicada debido a sus efectos citotóxicos. Tóxico para las células también es azul de metileno. Verde brillante

Para evitar la infección, especialmente cuando se trabaja con cicatrices hipertróficas, es posible tratar el campo operatorio con sulfato de neomicina, polimixina o gentamicina. No ejercen un efecto citotóxico sobre los queratinocitos.

Como resultado de este tratamiento, se logra un triple efecto.

1. Alineación de la superficie del rumen.
2. Crear una capa encima de una nueva epidermis, grosor normal.
3. Conversión de tejido cicatrizal en dermopodobnuyu por la acción de citoquinas, factores de crecimiento y otras moléculas bioactivas secretadas por las células y queratinocitos trasplantados estimuladas por ellos, fibroblastos y macrófagos.

La cicatriz se vuelve menos notoria, más elástica, aparecen poros, pelo hinchado, la pigmentación se puede restaurar debido a la presencia de melanocitos en el MPC.

Sin embargo, todos estos momentos positivos en la cicatriz no vienen de inmediato. En este sentido, es necesario advertir a los pacientes. Que el proceso de transformación del tejido cicatrizal en la dermis es lento y que el resultado óptimo de dicho tratamiento puede esperarse no antes de 10-14 meses. Inmediatamente después de rechazar el vendaje, las superficies pulidas tienen una policromía pronunciada, más brillante es el proceso de molienda. El menor daño a la piel ocurre cuando se muelen las cicatrices normotróficas con un láser de erbio. El color de las cicatrices y la piel circundante se restableció en el período de 3 a 8 semanas. A pesar de tales precauciones, a veces hay hiperpigmentación postoperatoria, que puede continuar de forma independiente durante varios meses.

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