La terapia génica no viral ofrece esperanza para el dolor lumbar crónico

En un estudio reciente publicado en la revista Biomaterials, los investigadores desarrollaron una nueva terapia genética no viral para tratar el dolor de espalda discogénico (PAD) mediante la administración del factor de transcripción Forkhead. Cuadro F1 (FOXF1) que utiliza vesículas extracelulares (eEV) diseñadas en discos intervertebrales degenerativos (DIV) in vivo.

El dolor lumbar (LBP) crónico es un problema global creciente debido al envejecimiento de la población y al empeoramiento de los problemas de opioides. Los tratamientos actuales incluyen alivio a corto plazo o cirugías costosas, lo que destaca la necesidad de terapias no adictivas y menos invasivas.

Las terapias biológicas actuales, incluida la administración de factores de crecimiento, la terapia celular y las terapias genéticas virales, pueden reducir la degeneración en modelos animales y humanos. Sin embargo, preocupaciones como los efectos a corto plazo, la escasa eficacia a largo plazo y la inmunogenicidad y tumorigenicidad innecesarias pueden impedir la aplicación directa de estos métodos.

En este estudio, los investigadores establecieron una terapia génica no viral para la degeneración del disco intervertebral (DIV) utilizando FOXF1-eEV.

Los investigadores transfectaron fibroblastos embrionarios de ratón primarios (PMEF) con un plásmido que contenía FOXF1 o pCMV6 como control y caracterizaron muestras de eEV mediante un ensayo de seguimiento de nanopartículas (NTA).

Evaluaron la carga eficiente de carga molecular en eEV mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) y la PCR convencional. El análisis de transferencia Western identificó FOXF1 y proteínas EV específicas en formaciones de eEV. El equipo utilizó plásmidos que mejoran las regiones de polienlazador aguas arriba y aguas abajo para determinar la presencia de ADN del plásmido FOXF1 en células donantes y generó eEV.

Examinaron el ARNm de longitud completa producido a partir de ADN plasmídico en eEV y células de donantes.

Los investigadores crearon vesículas extracelulares con factores de transcripción para restaurar la función del tejido y modificar las respuestas al dolor en un modelo animal de PAD.

Identificaron vehículos eléctricos para transportar y distribuir FOXF1 a los discos intervertebrales dañados en un modelo de ratón con dolor de espalda discogénico para determinar la inhibición de FOXF1 eEV de la degeneración del disco intervertebral.

El equipo combinó pruebas biomecánicas de discos intervertebrales de ratones con imágenes, cambios en la matriz extracelular (MEC) y respuestas al dolor evaluadas después de 12 semanas para confirmar los cambios en la estructura y función, así como el dolor inducido por la intervención terapéutica.

Las evaluaciones del dolor preoperatorias y posteriores al tratamiento incluyeron tomografía microcomputarizada (micro-CT), imágenes por resonancia magnética (MRI), pruebas mecánicas, tinción con azul alcián (AB) y rojo picrosirio (PSR), prueba de azul de dimetilmetileno e inmunohistoquímica (IHC). ) ).

El estudio implicó una técnica quirúrgica en la que los investigadores inyectaron buprenorfina ER por vía subcutánea en ratones para controlar el dolor posoperatorio.

El equipo realizó evaluaciones de comportamiento antes de la cirugía y cada dos semanas de cuatro a doce semanas después de la cirugía, utilizando una variedad de técnicas como la prueba de campo abierto, placa fría, suspensión de la cola y suspensión con alambre.

La prueba de campo abierto evaluó la actividad espontánea de los ratones; las pruebas de placa fría midieron hiperalgesia térmica; Las pruebas de suspensión de la cola midieron el dolor axial; y las pruebas de suspensión de alambre midieron la resistencia.

Doce semanas después de la cirugía, el equipo diseccionó las espinas lumbares de los animales, utilizando el trazado de la arteria y el nervio femoral para identificar los discos intervertebrales entre L4 y L5, L5 y L6, y L6 y S1 IVD. Utilizaron L5/L6 IVD para evaluar la histología y determinar el contenido de glucosaminoglicano (GAG).

Los FOXF1 eEV redujeron significativamente las respuestas al dolor al tiempo que restauraron la estructura y función del DIV, incluidas mejoras en la altura del disco, la hidratación del tejido, el contenido de proteoglicanos y las propiedades mecánicas.

El estudio se centró en la liberación de eEV cargados con FOXF1 a partir de fibroblastos primarios transfectados con el factor de transcripción FOXF1. La RT-PCR cuantitativa mostró un aumento significativo en los niveles de transcripción de ARNm de FOXF1 y en los niveles de ARNm de FOXF1 transcrito de longitud completa en comparación con las células transfectadas con pCMV6.

La terapia FOXF1 eEV puede reducir las respuestas al dolor en un modelo de ratón con punción de disco lumbar durante hasta 12 semanas. Los ratones hembra mostraron tiempos de adquisición más largos en el grupo tratado con FOXF1 que en el grupo lesionado, que duró al menos 12 semanas después del tratamiento.

La terapia FOXF1 eEV mejoró la hidratación y la altura del tejido IVD en animales lesionados y degenerativos in vivo mientras mantenía los niveles de hidratación y la intensidad de la imagen IVD ponderada en T2.

Sin embargo, el equipo observó una disminución en la altura del disco en animales heridos y en animales tratados con pCMV6 eEV. Los ratones tratados con FOXF1 eEV no tuvieron reducción en la altura del disco 12 semanas después del tratamiento. El género no influyó en los resultados funcionales.

Los eEV FOXF1 restauraron la función mecánica de los IVD dañados y degenerados in vivo. Bajo estrés axial, los DIV tratados con FOXF1 eEV mostraron una mayor rigidez NZ normalizada en comparación con los DIV dañados.

En condiciones de fluencia, los IVD dañados exhibieron mayores desplazamientos de fluencia normalizados, lo que indica una disminución en la rigidez elástica de fluencia normalizada.

Los resultados muestran que la reducción del contenido de GAG en los DIV dañados aumenta la flexibilidad mecánica, pero la terapia con eEV previene la pérdida de glucosaminoglucanos y los cambios posteriores en la función mecánica.

Los eEV FOXF1 provocaron cambios estructurales y funcionales en IVD al aumentar los niveles de proteoglicanos y GAG.

Los resultados del estudio mostraron que los eEV cargados con factores de transcripción del desarrollo pueden tratar enfermedades articulares dolorosas como la PAD al administrar estos factores de transcripción a las articulaciones IVD degenerativas y dolorosas.

Esta estrategia puede ayudar a reducir las anomalías estructurales y funcionales causadas por la enfermedad, así como a regular las respuestas al dolor específicas de cada género.

Los investigadores también han recomendado el uso de factores de transcripción del desarrollo como FOXF1 para convertir las células NP degenerativas en un estado proanabólico in vivo. Se necesitan más investigaciones para determinar su eficacia terapéutica.