Células madre hematopoyéticas

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) como células progenitoras mesenquimales se caracterizan por multipotencia y dan lugar a líneas celulares, elementos finitos que forman las células sanguíneas y algunas células de los tejidos especializados del sistema inmune.

La hipótesis de la existencia de un ancestro común de todas las células de la sangre, así como el término "célula madre", propiedad de A. Maximov (1909) El potencial de formación de masa celular de GSK enorme -. Células madre de médula ósea producen las células del día 10º que forman corpúsculos de la sangre del propio periférica. La existencia de células madre hematopoyéticas se estableció en 1961 en los experimentos sobre la recuperación de la hematopoyesis en ratones que recibieron una dosis letal de exposición a la radiación que destruye las células madre de la médula ósea. Pos es decir, el trasplante de células de médula ósea singénicas tan letalmente irradiados animales focos discretos de la hematopoyesis se detectaron en el bazo de los receptores cuya fuente - células progenitoras clonogénicas individuales.

Luego, se demostró la capacidad de autoprotección de las células madre hematopoyéticas, lo que proporciona la función de la hematopoyesis durante la ontogénesis. En el proceso de desarrollo embrionario, las HSCs se caracterizan por una alta actividad de migración, que es necesaria para su migración a los sitios de los órganos hematopoyéticos. Esta propiedad de las HSC también se retiene en la ontogénesis: debido a su migración constante, tiene lugar una renovación permanente del conjunto de células inmunocompetentes. La capacidad de migración GSK, la penetración a través de las barreras de los tejidos de la sangre, la implantación en el crecimiento del tejido y clonogénico proporcionó la base para células trasplante de médula ósea en un número de enfermedades asociadas con trastornos del sistema hematopoyético.

Al igual que todos los recursos de células madre, las células madre hematopoyéticas están presentes en su nicho (la médula ósea) en cantidades muy pequeñas, lo que conduce a ciertas dificultades en su asignación. HSCs humanas inmunofenotípicos se caracterizan como células CD34 + NK capaces de migrar en el torrente sanguíneo y colonizar órganos del sistema inmune o para repoblar el estroma de la médula ósea. Es necesario entender claramente que GSK no es las células de médula ósea más inmaduras, y se derivan a partir de precursores, que incluyen dormantnye células de fibroblastos SB34-negativas. Se encontró que las células con el fenotipo de CD34 son capaces de entrar en el torrente sanguíneo, donde cambian su fenotipo en el CD34 +, pero la migración de retorno en la médula ósea bajo la influencia del microentorno de nuevo se convierten en elementos de células madre CD34-negativas. En reposo, las células CD34 no responden a las señales del estroma reguladoras paracrinas (factores de crecimiento, citoquinas). Sin embargo, en situaciones que requieren las células madre hematopoyéticas de intensidad de amplificación con el CD34 fenotipo responder a las señales de diferenciación forman tanto hematopoyéticas y células progenitoras mesenquimales. Hematopoyesis se lleva a cabo por contacto directo con GSK elementos celulares del estroma de médula ósea presentó una compleja red de macrófagos, células endoteliales reticulares, osteoblastos, fibroblastos del estroma y la matriz extracelular. Bone marco estroma de la médula - no sólo una matriz o "esqueleto" de tejido hematopoyético, lleva regulación fina de la hematopoyesis debido a las señales de regulación paracrina de factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, y también proporciona interacciones adhesivas necesarias para la formación de células sanguíneas.

Por lo tanto, la base del sistema de hematopoyesis constantemente actualizado es la célula madre hematopoyética, que es capaz de auto mantenimiento prolongado, es polipotente (desde el punto de vista de la hematopoyesis). Durante el proceso de compromiso, las HSCs experimentan diferenciación primaria y forman clones de células que difieren en sus características citomorfológicas e inmunofenotípicas. La formación consecutiva de células progenitoras primitivas y comprometidas se completa mediante la formación de células antecesoras morfológicamente identificables de diversas líneas hematopoyéticas. El resultado de las etapas posteriores de un complejo proceso de hematopoyesis en múltiples etapas es la maduración de las células y la liberación a la sangre periférica de elementos maduros: eritrocitos, leucocitos, linfocitos y plaquetas.

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Fuentes de células madre hematopoyéticas

Las células madre hematopoyéticas se consideran la fuente de tallo más estudiado, que es en gran parte debido a su uso en la clínica del trasplante de médula ósea. A primera vista, estas células se conocen lo suficiente. Hasta cierto punto esto es cierto, ya que los descendientes intermedios y maduros GSK - los elementos celulares más asequibles, cada uno de los cuales (eritrocitos, leucocitos, linfocitos, monocitos / macrófagos y plaquetas) se estudiaron a fondo en todos los niveles - de la luz a Microscopía Electrónica, desde características bioquímicas y inmunofenotípicos para identificar por análisis de PCR. Sin embargo, el seguimiento llevado a cabo por morfológicas, ultraestructurales, bioquímica, inmufenotípico, y los parámetros biofísicos de la genómica GSK no ha dado respuestas a muchas cuestiones problemáticas, cuya solución es necesaria para el desarrollo del trasplante de células. Todavía no se ha establecido mecanismos de estabilización de GSK en estado latente, se activan, entrar en la etapa de la división simétrica o asimétrica, y lo más importante - de compromiso con la educación como funcionalmente diferentes células sanguíneas, eritrocitos, leucocitos, linfocitos y plaquetas.

La presencia en las células de médula ósea con el fenotipo de CD34, que son los ancestros de células madre tanto mesenquimales y hematopoyéticas ha planteado la cuestión de la existencia de los primeros cerca de las células CD34-negativas en la diferenciación de células progenitoras y la línea estromal hematopoyético. Método de cultivo prolongado se obtuvo mediante el llamado cultivo a largo plazo "iniciar células (cultivo iniciador de célula a largo plazo - LTC-IC). La vida útil de tales células progenitoras en colonia actividad del estroma de la médula ósea en base a una combinación de factores de crecimiento de formación es más de 5 semanas, mientras que la viabilidad de unidades formadoras de colonias (CFU) comprometidos en el cultivo de sólo 3 semanas. Se cree actualmente que el LTC-IC - análogo funcional GCW como repopulyatsionnom a un alto potencial de alrededor de 20% LTC-IC se caracterizan por un fenotipo CD34 + CD38- y exhiben una alta capacidad de auto-renovación. Tales células que se encuentran en la médula ósea humana con la frecuencia de una y cincuenta 000. Sin embargo, se debe reconocer células limfoidoinitsiiruyuschie-mieloide más próximos al HSC que se obtienen en condiciones de largo plazo (15 semanas) de la cultura. Tales células se designan como LTC, entre células de médula ósea humana se encuentran en 10 veces menos que el LTC-IC, y se forma como una líneas de células mieloides y el tallo hematopoyético linfoide.

Aunque las células madre hematopoyéticas etiquetado con anticuerpos monoclonales, seguido de identificación de inmunofenotípico es el principal método para la identificación y la clasificación selectiva de las células madre hematopoyéticas con el potencial uso clínico de GSK dedicado por lo tanto limitada. El bloqueo de anticuerpos contra el receptor CD34 u otros antígenos marcadores durante la clasificación immunopositive inevitablemente altera las propiedades de las células aisladas con él. Más preferido considerado immunonegativnoe selección de GSK en columnas magnéticas. Sin embargo, en este caso, la clasificación se utiliza generalmente anticuerpos monoclonales, fijados sobre un soporte de metal. También, de manera importante, tanto el método de asignación de GSK basa en fenotípica, en lugar de características funcionales. Por lo tanto, muchos investigadores prefieren utilizar el análisis de parámetros clonogénicas GSK, que permite que el tamaño y la composición de las colonias para determinar el grado de madurez y la dirección de la diferenciación de las células progenitoras. Se sabe que en el proceso de cometer el número de células y el número de tipos en las colonias se reduce. De células madre hematopoyéticas y su célula hija temprano, llamada "unidad de monocitos-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya granulocitos y eritrocitos" (SFU-GEMM), crean grandes colonias de un cultivo multilineal que contienen, respectivamente, granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacariocitos. Situado por debajo de la unidad de línea de granulocitos-linaje compromiso monotsitokolonieobrazuyuschaya (SFU-GM) genera colonias de granulocitos y macrófagos, y unidades formadoras de colonias granulocíticas (SFU-G) - sólo pequeñas colonias de granulocitos maduros. Early predecesor de eritrocitos - unidad burstoobrazuyuschaya de las células rojas de la sangre (SFU-E) - es una fuente de unidad grande y más maduro de colonias de células rojas de la sangre de formación (SFU-E) - pequeñas colonias de células de sangre rojas. En la población general, con el crecimiento de células en medios semisólidos pueden identificar las células que forman seis tipos de colonias mieloides: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E y E-SFU).

Sin embargo, además de los derivados hematopoyéticos, cualquier material fuente para el aislamiento de HSC contiene un número significativo de células concomitantes. A este respecto, es necesaria una purificación preliminar del trasplante, en primer lugar, de las células activas del sistema inmune del donante. Usualmente, para esto se usa la inmunosección basada en la expresión de linfocitos de antígenos específicos, lo que permite aislarlos y eliminarlos usando anticuerpos monoclonales. Además, un trasplante de médula ósea técnica immunorozetochnaya de linfocitos T empobrecido, que se basa en la formación de complejos de los linfocitos CD4 + y anticuerpos monoclonales específicos elimina eficientemente usando aféresis. Esta técnica proporciona un material celular purificado con 40-60% de células madre hematopoyéticas.

El aumento del número de células progenitoras debido a la eliminación de células sanguíneas maduras a partir de un producto de leucoféresis se logra por centrifugación a contracorriente, seguido de filtración (en presencia del quelante - citrato trisódico) a través de una columna que contiene fibras de nylon recubiertas con inmunoglobulina humana. El uso secuencial de estas dos técnicas proporciona la limpieza completa del injerto a partir de plaquetas en un 89% - de los eritrocitos y en un 91% - a partir de leucocitos. Debido a la reducción significativa de las pérdidas nivel GSK de células CD34 + en la masa celular total puede ser elevado a 50%.

Para las características funcionales de las células madre hematopoyéticas aisladas, se usa su capacidad para crear colonias de elementos de sangre maduros en cultivo. El análisis de las colonias formadas permite identificar y cuantificar los tipos de células progenitoras, el grado de su compromiso y establecer la dirección de su diferenciación. La actividad clonogénica se determina en medios semisólidos sobre metilcelulosa, agar, plasma o gel de fibrina, lo que reduce la actividad de migración de las células, lo que impide su fijación a la superficie del vidrio o el plástico. En condiciones de cultivo óptimas, los clones de una sola célula se desarrollan dentro de 7-18 días. Si hay menos de 50 celdas en el clon, se identifica como un solo clúster, si el número de celdas excede 50 - como una colonia. Se tiene en cuenta el número de células capaces de formar una colonia (unidades formadoras de colonias - UFC o células formadoras de colonias - AOC). Cabe señalar que los parámetros y COC CFU no se corresponden con el número de HSC en la suspensión de células, a pesar de que se correlaciona con la que de nuevo enfatiza la necesidad de identificar la actividad funcional (formación de colonias) de HSCs in vitro.

Entre las células de la médula ósea, las células madre hematopoyéticas tienen el mayor potencial proliferativo, debido a lo cual las colonias más grandes se forman en cultivo. Por el número de tales colonias, se propone determinar indirectamente el número de células madre. Después de la formación de colonias in vitro inferior o igual a 0,5 mm de diámetro y con el número de células 1000, los autores han probado la estabilidad de estas células para subletales dosis de 5-fluorouracilo y examinó su capacidad para repoblar la médula ósea letalmente animales irradiados. De acuerdo con estos parámetros, las células aisladas no difirieron mucho de HSC y recibieron el símbolo de abreviación HPP-CFC - células formadoras de colonias con un alto potencial proliferativo.

La búsqueda de la posibilidad de una selección más cualitativa de células madre hematopoyéticas continúa. Sin embargo, las células hematopoyéticas del tallo son morfológicamente similares a los linfocitos y representan un conjunto relativamente homogéneo de células con núcleos casi redondos, cromatina finamente dispersa y una pequeña cantidad de citoplasma débilmente basófilo. El número exacto también es difícil de determinar. Se supone que GSK en la médula ósea de una persona ocurre con una frecuencia de 1 por 106 células que contienen núcleos.

Identificación de células madre hematopoyéticas

Para mejorar la identificación de células madre hematopoyéticas se lleva a cabo secuencial o simultáneamente (en una tere sorbitán multicanal) investigación espectro membrannosvyazannyh de antígenos, en el que GSK fenotipo CD34 + CD38 se debe combinar con la falta de marcadores de diferenciación lineal, en particular los antígenos de las células inmunocompetentes tales como CD4, y inmunoglobulinas de superficie glicoforina.

Prácticamente todos los esquemas de fenotipado de células madre hematopoyéticas incluyen la determinación del antígeno CD34. Esta glicoproteína con una masa molecular de aproximadamente 110 kDa, que llevan varios sitios de glicosilación expresa en la membrana de células plasmáticas después de la activación del gen localizado en el cromosoma 1. La función de la molécula CD34 está asociada con la interacción mediada por L-selectina de células precursoras hematopoyéticas tempranas con la base del estroma de médula ósea. Sin embargo, se debe recordar que la presencia de antígeno CD34 en la superficie celular sólo permite realizar una evaluación preliminar del contenido de GSK en la suspensión de células, tal como se expresa, y otras células progenitoras hematopoyéticas y células estromales de médula ósea y células endoteliales.

Durante la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas, la expresión de CD34 se reduce permanentemente. Las células progenitoras comprometidas con eritrocitos, granulocitos y monocitos expresan débilmente el antígeno CD34, o están ausentes en su superficie en absoluto (fenotipo CD34). En la membrana superficial de las células diferenciadas de la médula ósea y las células sanguíneas maduras, no se detecta el antígeno CD34.

Cabe señalar que en la dinámica de la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas no sólo reduce el nivel de expresión de CD34, pero paralela aumentado progresivamente la expresión del antígeno CD38 - glicoproteína de membrana integral con el peso molecular de la actividad de adenilato ADP-ribosil 46 kDa que tiene NAD-glikogidrolaznoy y, lo que sugiere su implicación en el transporte y la síntesis de ADP-ribosa. Por lo tanto, existe la posibilidad de un control dual del grado de compromiso de las células progenitoras hematopoyéticas. Población de células con el fenotipo CD34 + CD38 +, de células de médula ósea CD34-positivas 90 a 99% comprende las células progenitoras con diferenciación potencial y proliferativa limitada, mientras que con el fenotipo de las células CD34 + CD38 pueden reclamar el papel de GSK.

De hecho, la población de células de médula ósea descrita por la fórmula CD34 + CD38- contiene un número relativamente grande de células madre primitivas que pueden diferenciarse en las direcciones mieloide y linfoide. En el contexto de cultivo a largo plazo con el fenotipo de las células CD34 + CD38- administrar para obtener todas las células sanguíneas maduras: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, los megacariocitos, eritrocitos y linfocitos.

Relativamente recientemente se encontró que las células CD34-positivas expresan dos marcadores más - AC133 y CD90 (Thy-1), que también se utiliza para identificar células madre hematopoyéticas. Antígeno Thy-1 se co-expresó con el receptor CD117 (c-kit) en células CD34 + de médula ósea, cordón umbilical y sangre periférica. Se trata de una glicoproteína de unión al fosfatidilinositol superficial con un peso molecular de 25-35 kDa, que participa en los procesos de adhesión celular. Algunos autores creen que el antígeno Thy-1 es el marcador de las células CD34 positivas más inmaduras. Las células autorreproductoras con el fenotipo CD34 + Thy-1 + dan lugar a líneas de cultivo prolongado con la formación de células hijas. Se sugiere que el antígeno Thy-1 bloquea las señales reguladoras que hacen que la división celular se detenga. A pesar del hecho de que las células CD34 + TU1 + son capaces de auto-renovación y la creación de líneas cultivadas a largo plazo, su fenotipo no puede referirse únicamente a las HSC, como Thy-1 + contenido en el peso total de los elementos de células CD34-positivas es de aproximadamente 50%, muy superior a la la cantidad de células hematopoyéticas.

Más prometedor para la identificación de células madre hematopoyéticas es AC133, un marcador de antígeno de células progenitoras hematopoyéticas, cuya expresión se detectó por primera vez en células hepáticas embrionarias. AC133 es una glucoproteína transmembrana que aparece en la superficie de la membrana celular en las etapas más tempranas de la maduración de GSK; es posible que incluso antes que el antígeno CD34. En los estudios de A. Petrenko y V. Grishchenko (2003), se encontró que AC133 expresa hasta 30% de las células positivas para CD34 del hígado embrionario.

Por lo tanto, el perfil ideal fenotípica de las células madre hematopoyéticas por los conceptos actuales, la suma de contorno celular, en los circuitos que debe estar presente CD34 antígenos configuración, AC133 y Thy-1, pero no hay lugar para CD38 proyecciones molecular, HLA-DR y marcadores GPA diferenciación lineal , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

La variación del retrato fenotípico de HSC puede ser una combinación de CD34 + CD45RalowCD71low, ya que las propiedades de las células descritas por esta fórmula no difieren de los parámetros funcionales de las células con el fenotipo CD34 + CD38. Además, HSC humana puede ser identificado por signos fenotípicos CD34 + Thy-l + CD38Iow / 'c-kit / bajo - sólo 30 de estas células restaurar completamente la hematopoyesis en ratones irradiados letalmente.

A partir del análisis de las características fenotípicas generales de células de médula ósea en realidad comenzó 40 años de investigación intensiva GSK simultáneamente capaz tanto de auto-renovación y la diferenciación de otros elementos celulares, lo que permite para justificar el uso de transplante de médula ósea para tratar diversas patologías del sistema hematopoyético. Los nuevos tipos de células madre recientemente descubiertos aún no se han utilizado ampliamente en la práctica clínica. Sin embargo, las células de sangre de cordón umbilical (cordón umbilical) y el hígado fetal puede ampliar significativamente el trasplante de células no sólo en hematología, sino también en otros campos de la medicina, como diferentes de HSC de la médula ósea como un cuantitativos características de rendimiento y la calidad del fuste.

Masa de células madre hematopoyéticas de desplazamiento necesario para el trasplante se obtienen generalmente a partir de médula ósea, sangre periférica y el cable, así como el hígado embrionario. Además, las células progenitoras hematopoyéticas se pueden obtener mediante la propagación in vitro de ESC y su diferenciación posterior en hematopoyético dirigidos elementos celulares. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) señalan acertadamente diferencias significativas propiedades inmunológicas y la capacidad de restaurar la hematopoyesis GSK origen diferente, debido a la relación desigual contenida en sus fuentes de pluripotentes temprano y progenitores más tarde comprometidos. Además, las células madre hematopoyéticas derivadas de diferentes fuentes de tallo tienen asociaciones completamente diferentes de células no hematopoyéticas cuantitativa y cualitativamente.

Una fuente tradicional de células madre hematopoyéticas es la médula ósea. Se obtiene una suspensión de células de médula ósea del hueso o esternón abdominal mediante lixiviación bajo anestesia local. La suspensión así obtenida es heterogénea y contiene una mezcla de HSC, elementos de células estromales, células progenitoras comprometidas de las líneas mieloide y linfoide, así como elementos de sangre maduros. El número de células con los fenotipos CD34 + y CD34 + CD38 entre las células mononucleares de la médula ósea es de 0,5 a 3,6 y de 0 a 0,5%, respectivamente. La sangre periférica después de la movilización de HSC inducida por G-CSF contiene 0,4-1,6% de CD34 + y 0-0,4% de CD34 + CD38.

Un mayor porcentaje de células con CD34 + inmunofenotipo CD38 y sangre de cordón CD34 + - y 0-0,6 OD-2,6%, y su número máximo es detectado entre las células de hígado fetal hematopoyéticas - y 2,3 0,2-12,5 -35.8%, respectivamente.

Sin embargo, la calidad de material de injerto no sólo depende de la cantidad contenida en el mismo de células CD34 +, sino también de su actividad funcional, que se puede estimar por el nivel de formación de colonias in vivo (repoblación ósea en animales letalmente irradiados) y en vitro - de crecimiento de las colonias en medios semisólidos . Se encontró que la formación de la colonia y de la actividad proliferativa de las células progenitoras hematopoyéticas con el fenotipo CD34 + CD38 HLA-DR, aislado a partir de hígado fetal, médula ósea fetal y sangre de cordón, y excede en gran medida la capacidad proliferativa de las células formadoras de colonias hematopoyéticas de la médula ósea y la sangre periférica de un adulto. El análisis cuantitativo y cualitativo de HSC de diversos orígenes reveló diferencias significativas tanto en su contenido relativo en la suspensión celular como en sus capacidades funcionales. Se encontró el número máximo de células CD34 + (24.6%) en el material de trasplante obtenido de la médula ósea fetal. La médula ósea de un ser humano adulto contiene un 2,1% de elementos celulares positivos para CD34. Entre las células mononucleares de sangre periférica humana de adultos sólo el 0,5% tenían un fenotipo CD34 +, mientras que la sangre del cordón su cantidad alcanza 2%. Por lo tanto formadoras de colonias capacidad de células CD34 + de médula ósea fetal por 2,7 veces superior a la capacidad de crecimiento clonal de médula ósea hematopoyética de células humanas adultas y células de sangre de cordón formar colonias considerablemente más grandes que los elementos hematopoyéticas aisladas de sangre periférica de adultos: 65,5 a 40 y , 8 colonias / 105 células, respectivamente.

Las diferencias en la actividad proliferativa y la capacidad de formación de colonias de las células madre hematopoyéticas están asociadas no solo con diferentes grados de madurez, sino también con su microambiente natural. Se sabe que la intensidad de la proliferación y diferenciación de células madre velocidad determinada por la influencia reguladora integral del sistema de componentes múltiples de factores de crecimiento y citocinas que son producidos tanto por las células madre y elementos celulares de microambiente matriz estromal. Usando las poblaciones de células purificadas y medio libre de suero con vistas al cultivo celular dando factores de crecimiento caracterizados que tienen un efectos estimuladores e inhibidores sobre las células madre de varios niveles, células progenitoras y células de comprometido en una dirección lineal particular. Los resultados de los estudios conducidos prueban convincentemente que GSK, obtenido a partir de fuentes con diferentes niveles de desarrollo ontogenético, difiere tanto fenotípicamente como funcionalmente. Para GSK, permanecer en las primeras etapas de ontogenia, que se caracteriza por un alto potencial de auto-reproducción y alta actividad proliferativa. Tales células se distinguen por una longitud de telómero más larga y están sujetas a comprometerse con la formación de todas las líneas celulares hematopoyéticas. La reacción del sistema inmune al origen embrionario de HSC se retrasa, ya que tales células expresan moderadamente las moléculas de HLA. Hay una clara gradación del contenido relativo de HSCs y su capacidad de auto-renovación y el número de líneas que forman tipos de compromiso: células CD34 + de hígado fetal> células CD34 + de sangre de cordón> CD34 + células de la médula ósea. Es importante que tales diferencias no son exclusivos de intra y neo postanatalnomu período temprano del desarrollo humano, sino también a lo largo de la ontogenia - proliferativa y actividad de formación de colonias de HSCs derivadas de médula ósea o sangre periférica de un adulto, inversamente proporcional a la edad del donante.