Células madre hematopoyéticas

Las células madre hematopoyéticas (CMH), al igual que las células progenitoras mesenquimales, se caracterizan por su multipotencia y dan lugar a líneas celulares cuyos elementos finales forman los elementos formes de la sangre, así como una serie de células tisulares especializadas del sistema inmunitario.

La hipótesis de la existencia de un precursor común de todas las células sanguíneas, así como el término "célula madre" en sí, pertenece a A. Maksimov (1909). El potencial para la formación de masa celular en HSC es enorme: las células madre de la médula ósea producen diariamente 10 células que componen los elementos formados de la sangre periférica. El hecho mismo de la existencia de células madre hematopoyéticas se estableció en 1961 en experimentos sobre la restauración de la hematopoyesis en ratones que recibieron una dosis letal de irradiación radiactiva que destruye las células madre de la médula ósea. Después del trasplante de células de médula ósea singénicas a estos animales letalmente irradiados, se encontraron focos discretos de hematopoyesis en el bazo de los receptores, cuya fuente eran células precursoras clonogénicas individuales.

Posteriormente, se demostró la capacidad de las células madre hematopoyéticas para automantenerse, proporcionando la función de hematopoyesis en el proceso de ontogénesis. Durante el desarrollo embrionario, las células madre hematopoyéticas se distinguen por una alta actividad migratoria, necesaria para su desplazamiento a las zonas de formación de los órganos hematopoyéticos. Esta propiedad de las células madre hematopoyéticas también se conserva en la ontogénesis: debido a su migración constante, se produce una renovación permanente del conjunto de células inmunocompetentes. La capacidad de las células madre hematopoyéticas para migrar, atravesar barreras histohemáticas, implantarse en tejidos y desarrollar crecimiento clonogénico sirvió de base para el trasplante de células de médula ósea en diversas enfermedades asociadas con la patología del sistema hematopoyético.

Como todas las células madre, las células madre hematopoyéticas se encuentran en su nicho (la médula ósea) en cantidades muy pequeñas, lo que dificulta su aislamiento. Inmunofenotípicamente, las células madre hematopoyéticas humanas se caracterizan por ser células NK CD34+ capaces de migrar al torrente sanguíneo y poblar los órganos del sistema inmunitario o repoblar el estroma de la médula ósea. Es importante comprender que las células madre hematopoyéticas no son las células más inmaduras de la médula ósea, sino que se originan a partir de precursores, que incluyen células CD34-negativas latentes similares a fibroblastos. Se ha establecido que las células con fenotipo CD34 pueden ingresar al torrente sanguíneo general, donde cambian su fenotipo a CD34+, pero al migrar de forma inversa a la médula ósea, bajo la influencia del microambiente, se convierten nuevamente en elementos de células madre CD34-negativas. En estado de reposo, las células CD34~ no responden a las señales reguladoras paracrinas del estroma (factores de crecimiento, citocinas). Sin embargo, en situaciones que requieren una mayor intensidad de la hematopoyesis, las células madre con el fenotipo CD34 responden a las señales de diferenciación formando células progenitoras hematopoyéticas y mesenquimales. La hematopoyesis se produce mediante el contacto directo de las HSC con elementos celulares del estroma de la médula ósea, representado por una compleja red de macrófagos, células endoteliales reticulares, osteoblastos, fibroblastos estromales y matriz extracelular. La base estromal de la médula ósea no es solo una matriz o "esqueleto" para el tejido hematopoyético; lleva a cabo una fina regulación de la hematopoyesis gracias a las señales reguladoras paracrinas de factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas, y también proporciona interacciones adhesivas necesarias para la formación de células sanguíneas.

Así, el sistema de hematopoyesis, en constante renovación, se basa en una célula madre hematopoyética polipotente (desde el punto de vista de la hematopoyesis), capaz de automantenerse a largo plazo. Durante el proceso de compromiso, las CMH experimentan una diferenciación primaria y forman clones celulares que difieren en características citomorfológicas e inmunofenotípicas. La formación secuencial de células progenitoras primitivas y comprometidas culmina con la formación de células progenitoras morfológicamente identificables de diversas líneas hematopoyéticas. El resultado de las etapas posteriores del complejo proceso multietapa de la hematopoyesis es la maduración celular y la liberación de elementos formados maduros (eritrocitos, leucocitos, linfocitos y trombocitos) a la sangre periférica.

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Fuentes de células madre hematopoyéticas

Las células madre hematopoyéticas se consideran la fuente de células madre más estudiada, debido en gran medida a su uso clínico en el trasplante de médula ósea. A primera vista, se sabe bastante sobre estas células. Hasta cierto punto, esto es cierto, ya que los descendientes intermedios y maduros de las HSC son los elementos celulares más accesibles, cada uno de los cuales (eritrocitos, leucocitos, linfocitos, monocitos/macrófagos y plaquetas) se ha estudiado cuidadosamente a todos los niveles: desde la microscopía óptica hasta la electrónica, desde las características bioquímicas e inmunofenotípicas hasta la identificación mediante métodos de análisis por PCR. Sin embargo, el monitoreo de los parámetros morfológicos, ultraestructurales, bioquímicos, inmunofenotípicos, biofísicos y genómicos de las HSC no ha proporcionado respuestas a muchas cuestiones problemáticas, cuya solución es necesaria para el desarrollo de la transplantología celular. Los mecanismos de estabilización de las células madre hematopoyéticas en estado latente, su activación, entrada en la fase de división simétrica o asimétrica y, lo más importante, su compromiso con la formación de elementos formados funcionalmente diferentes de la sangre, como eritrocitos, leucocitos, linfocitos y plaquetas, aún no se han establecido.

La presencia en la médula ósea de células con fenotipo CD34, progenitoras de células madre mesenquimales y hematopoyéticas, planteó la cuestión de la existencia de los primeros precursores de la diferenciación celular en linajes estromales y hematopoyéticos, cercanos a las células CD34-negativas. Las denominadas células iniciadoras de cultivo a largo plazo (LTC-IC) se obtuvieron mediante el método de cultivo a largo plazo. La vida útil de estas células precursoras con actividad formadora de colonias en la base estromal de la médula ósea, con una determinada combinación de factores de crecimiento, supera las 5 semanas, mientras que la viabilidad de las unidades formadoras de colonias (UFC) comprometidas en cultivo es de tan solo 3 semanas. Actualmente, las LTC-IC se consideran un análogo funcional de las HSC, ya que, con un alto potencial de repoblación, aproximadamente el 20 % de las LTC-IC se caracterizan por el fenotipo CD34+CD38- y presentan una alta capacidad de autorrenovación. Estas células se encuentran en la médula ósea humana con una frecuencia de 1:50.000. Sin embargo, las células iniciadoras mieloide-linfoides, obtenidas en condiciones de cultivo a largo plazo (15 semanas), deben considerarse las más cercanas a las CMH. Estas células, denominadas LTC, se encuentran entre las células de la médula ósea cerebral humana y se encuentran con una frecuencia 10 veces menor que las LTC-IC, y forman líneas celulares de linajes hematopoyéticos tanto mieloide como linfoide.

Aunque el marcaje de células madre hematopoyéticas con anticuerpos monoclonales, seguido de la identificación inmunofenotípica, es el principal método para el reconocimiento y la clasificación selectiva de células hematopoyéticas con potencial madre, la aplicación clínica de las CMH aisladas de este modo es limitada. El bloqueo del receptor CD34 u otros antígenos marcadores con anticuerpos durante la clasificación inmunopositiva modifica inevitablemente las propiedades de la célula aislada con su ayuda. Se considera más preferible el aislamiento inmunonegativo de CMH en columnas magnéticas. Sin embargo, en este caso, se suelen utilizar anticuerpos monoclonales fijados en un soporte metálico para la clasificación. Además, ambos métodos de aislamiento de CMH se basan en características fenotípicas más que funcionales. Por lo tanto, muchos investigadores prefieren el análisis de los parámetros clonogénicos de las CMH, que permite determinar el grado de madurez y la dirección de la diferenciación de las células progenitoras mediante el tamaño y la composición de las colonias. Se sabe que durante el proceso de compromiso, el número de células y sus tipos en la colonia disminuye. La célula madre hematopoyética y su célula hija temprana, llamada "unidad formadora de colonias de granulocitos-eritrocito-monocito-megacariocito" (CFU-GEMM), crean grandes colonias multilinaje en cultivo que contienen granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacariocitos, respectivamente. La unidad formadora de colonias de granulocitos-monocito (CFU-GM), ubicada aguas abajo a lo largo de la línea de compromiso, forma colonias de granulocitos y macrófagos, y la unidad formadora de colonias de granulocitos (CFU-G) forma solo una pequeña colonia de granulocitos maduros. El precursor eritrocítico temprano, la unidad formadora de eritrocitos en ráfaga (CFU-E), es la fuente de grandes colonias de eritrocitos, y la unidad formadora de colonias de eritrocitos más madura (CFU-E) es la fuente de pequeñas colonias de eritrocitos. En general, cuando las células crecen en medios semisólidos, se pueden identificar células que forman seis tipos de colonias mieloides: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E y CFU-E).

Sin embargo, además de los derivados hematopoyéticos, cualquier material de partida para aislar células madre hematopoyéticas contiene una cantidad significativa de células acompañantes. Por ello, es necesaria una purificación preliminar del trasplante, en primer lugar, a partir de células activas del sistema inmunitario del donante. Habitualmente, se utiliza la inmunoselección para este fin, basada en la expresión de antígenos específicos por los linfocitos, lo que permite aislarlos y eliminarlos mediante anticuerpos monoclonales. Además, se ha desarrollado un método de inmunoroseta para la depleción de linfocitos T en el trasplante de médula ósea, basado en la formación de complejos de linfocitos CD4+ y anticuerpos monoclonales específicos, que se eliminan eficazmente mediante aféresis. Este método garantiza la producción de material celular purificado con un contenido de células madre hematopoyéticas del 40 al 60 %.

El aumento del número de células progenitoras, gracias a la eliminación de los elementos formados maduros de la sangre del producto de leucoféresis, se logra mediante centrifugación a contracorriente seguida de filtración (en presencia de un quelante, citrato trisódico) a través de columnas con fibras de nailon recubiertas de inmunoglobulina humana. El uso secuencial de estos dos métodos garantiza la purificación completa del trasplante de plaquetas, el 89 % de eritrocitos y el 91 % de leucocitos. Gracias a una disminución significativa en la pérdida de células madre hematopoyéticas (CMH), el nivel de células CD34+ en la masa celular total puede aumentar hasta el 50 %.

La capacidad de las células madre hematopoyéticas aisladas para formar colonias de células sanguíneas maduras en cultivo se utiliza para la caracterización funcional de las células. El análisis de las colonias formadas permite identificar y cuantificar los tipos de células progenitoras, el grado de su compromiso y establecer la dirección de su diferenciación. La actividad clonogénica se determina en medios semisólidos en metilcelulosa, agar, plasma o gel de fibrina, que reducen la actividad migratoria de las células, impidiendo su adhesión a la superficie del vidrio o plástico. En condiciones óptimas de cultivo, los clones se desarrollan a partir de una sola célula en 7-18 días. Si un clon contiene menos de 50 células, se identifica como un solo grupo; si el número de células supera las 50, se identifica como una colonia. Se tiene en cuenta el número de células capaces de formar una colonia (unidades formadoras de colonias - UFC o células formadoras de colonias - COC). Cabe señalar que los parámetros de UFC y COC no corresponden al número de HSC en la suspensión celular, aunque se correlacionan con él, lo que enfatiza una vez más la necesidad de determinar la actividad funcional (formadora de colonias) de las HSC in vitro.

Entre las células de la médula ósea, las células madre hematopoyéticas presentan el mayor potencial proliferativo, por lo que forman las colonias más grandes en cultivo. Se propone que el número de estas colonias determine indirectamente el número de células madre. Tras la formación in vitro de colonias con un diámetro superior a 0,5 mm y un recuento celular superior a 1000, los autores analizaron su resistencia a dosis subletales de 5-fluorouracilo y estudiaron su capacidad para repoblar la médula ósea de animales sometidos a irradiación letal. Según los parámetros especificados, las células aisladas eran prácticamente indistinguibles de las células madre hematopoyéticas (CMH) y recibieron la abreviatura HPP-CFC (células formadoras de colonias con alto potencial proliferativo).

La búsqueda de un aislamiento de mayor calidad de células madre hematopoyéticas continúa. Sin embargo, estas células son morfológicamente similares a los linfocitos y representan un conjunto relativamente homogéneo de células con núcleos casi redondos, cromatina finamente dispersa y una pequeña cantidad de citoplasma débilmente basófilo. Su número exacto también es difícil de determinar. Se supone que las células madre hematopoyéticas en la médula ósea humana se presentan con una frecuencia de 1 por cada 106 células nucleadas.

Identificación de células madre hematopoyéticas

Para mejorar la calidad de identificación de las células madre hematopoyéticas, se realiza un estudio secuencial o simultáneo (en un clasificador multicanal) del espectro de antígenos unidos a la membrana, y en las HSC se debe combinar el fenotipo CD34+CD38 con la ausencia de marcadores de diferenciación lineal, especialmente antígenos de células inmunocompetentes, como CD4, inmunoglobulinas de superficie y glicoforina.

Casi todos los esquemas de fenotipado de células madre hematopoyéticas incluyen la determinación del antígeno CD34. Esta glicoproteína, con un peso molecular aproximado de 110 kDa y varios sitios de glicosilación, se expresa en la membrana plasmática tras la activación del gen correspondiente localizado en el cromosoma 1. La función de la molécula CD34 está asociada a la interacción, mediada por L-selectina, de las células progenitoras hematopoyéticas tempranas con la base estromal de la médula ósea. Sin embargo, cabe recordar que la presencia del antígeno CD34 en la superficie celular solo permite una evaluación preliminar del contenido de CMH en la suspensión celular, ya que también lo expresan otras células progenitoras hematopoyéticas, así como las células estromales de la médula ósea y las células endoteliales.

Durante la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas, la expresión de CD34 se reduce permanentemente. Las células progenitoras comprometidas, eritrocíticas, granulocíticas y monocíticas, expresan débilmente el antígeno CD34 o no lo expresan en absoluto en su superficie (fenotipo CD34). El antígeno CD34 no se detecta en la membrana superficial de las células de la médula ósea diferenciadas ni de las células sanguíneas maduras.

Cabe destacar que en la dinámica de diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas no solo disminuye el nivel de expresión de CD34, sino que también aumenta progresivamente la expresión del antígeno CD38, una glicoproteína integral de membrana con un peso molecular de 46 kDa, que posee actividad de NAD-glicohidrolasa y ADP-ribosil ciclasa, lo que sugiere su participación en el transporte y síntesis de ADP-ribosa. Por lo tanto, surge la posibilidad de un doble control del grado de compromiso de las células progenitoras hematopoyéticas. La población de células con fenotipo CD34+CD38+, que constituye del 90 al 99% de las células de médula ósea CD34-positivas, contiene células progenitoras con un potencial proliferativo y diferenciador limitado, mientras que las células con fenotipo CD34+CD38 pueden reivindicar el papel de las HSC.

De hecho, la población celular de la médula ósea, descrita por la fórmula CD34+CD38-, contiene un número relativamente elevado de células madre primitivas capaces de diferenciarse en las direcciones mieloide y linfoide. En condiciones de cultivo a largo plazo de células con el fenotipo CD34+CD38-, es posible obtener todos los elementos formados maduros de la sangre: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, megacariocitos, eritrocitos y linfocitos.

Se ha establecido relativamente recientemente que las células CD34-positivas expresan dos marcadores más, AC133 y CD90 (Thy-1), que también se utilizan para identificar células madre hematopoyéticas. El antígeno Thy-1 se coexpresa con el receptor CD117 (c-kit) en células CD34+ de la médula ósea, cordón umbilical y sangre periférica. Es una glicoproteína de superficie que se une al fosfatidilinositol con un peso molecular de 25-35 kDa, que participa en los procesos de adhesión celular. Algunos autores creen que el antígeno Thy-1 es un marcador de las células CD34-positivas más inmaduras. Las células autorreproductoras con el fenotipo CD34+Thy-1+ dan lugar a líneas cultivadas a largo plazo con la formación de células hijas. Se asume que el antígeno Thy-1 bloquea las señales reguladoras que causan la detención de la división celular. A pesar de que las células CD34+Thy1+ son capaces de autoreproducirse y crear líneas cultivadas a largo plazo, su fenotipo no puede atribuirse exclusivamente a las HSC, ya que el contenido de Thy-1+ en la masa total de elementos celulares CD34-positivos es de alrededor del 50%, lo que supera significativamente el número de células hematopoyéticas.

Un marcador más prometedor para la identificación de células madre hematopoyéticas es el AC133, un marcador antigénico de células progenitoras hematopoyéticas, cuya expresión se detectó por primera vez en células hepáticas embrionarias. El AC133 es una glicoproteína transmembrana que aparece en la superficie de la membrana celular en las primeras etapas de la maduración de las células madre hematopoyéticas, posiblemente incluso antes que el antígeno CD34. En los estudios de A. Petrenko y V. Grishchenko (2003), se estableció que el AC133 se expresa en hasta el 30 % de las células hepáticas embrionarias CD34-positivas.

Así, el perfil fenotípico ideal de las células madre hematopoyéticas, según los conceptos actuales, consiste en un contorno celular, cuyos contornos deben incluir configuraciones de los antígenos CD34, AC133 y Thy-1, pero no hay espacio para las proyecciones moleculares de CD38, HLA-DR y los marcadores de diferenciación lineal GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Una variación del perfil fenotípico de las CPH podría ser la combinación CD34+CD45RalowCD71low, ya que las propiedades de las células descritas por esta fórmula no difieren de los parámetros funcionales de las células con el fenotipo CD34+CD38. Además, las CPH humanas pueden identificarse por las características fenotípicas CD34+Thy-l+CD38Ilow/'c-kit/low; solo 30 de estas células restauran completamente la hematopoyesis en ratones sometidos a irradiación letal.

El período de 40 años de investigación intensiva sobre las células madre hematopoyéticas (CMH), capaces tanto de autorreproducirse como de diferenciarse en otros elementos celulares, comenzó con el análisis de las características fenotípicas generales de las células de la médula ósea, lo que permitió justificar el uso del trasplante de médula ósea para el tratamiento de diversas patologías del sistema hematopoyético. Los nuevos tipos de células madre descubiertos posteriormente aún no se han utilizado ampliamente en la práctica clínica. Al mismo tiempo, las células madre de sangre de cordón umbilical y de hígado embrionario pueden ampliar significativamente el alcance del trasplante celular no solo en hematología, sino también en otras áreas de la medicina, ya que difieren de las CMH de médula ósea tanto en características cuantitativas como cualitativas.

El volumen de masa de células madre hematopoyéticas necesario para el trasplante suele obtenerse de médula ósea, sangre periférica y de cordón umbilical, e hígado embrionario. Además, las células progenitoras hematopoyéticas pueden obtenerse in vitro mediante la multiplicación de células madre hematopoyéticas (CME) con su posterior diferenciación dirigida en elementos celulares hematopoyéticos. A. Petrenko y V. Grishchenko (2003) señalan con acierto diferencias significativas en las propiedades inmunológicas y la capacidad de restaurar la hematopoyesis de las CMH de diferentes orígenes, lo que se debe a la proporción desigual de células progenitoras pluripotentes tempranas y tardías contenidas en sus fuentes. Además, las células madre hematopoyéticas obtenidas de diferentes fuentes madre se caracterizan por asociaciones cuantitativa y cualitativamente completamente diferentes de células no hematopoyéticas.

La médula ósea se ha convertido en una fuente tradicional de células madre hematopoyéticas. La suspensión de células de médula ósea se obtiene del íleon o del esternón mediante lavado con anestesia local. La suspensión obtenida de este modo es heterogénea y contiene una mezcla de células madre hematopoyéticas (CMH), elementos de células estromales, células progenitoras comprometidas de líneas mieloides y linfoides, así como elementos formados maduros de la sangre. El número de células con fenotipos CD34+ y CD34+CD38 entre las células mononucleares de la médula ósea es del 0,5-3,6% y del 0-0,5%, respectivamente. La sangre periférica, tras la movilización de CMH inducida por G-CSF, contiene del 0,4-1,6% de CD34+ y del 0-0,4% de CD34+CD38.

El porcentaje de células con los inmunofenotipos CD34+CD38 y CD34+ es mayor en la sangre del cordón umbilical - 0-0,6 y 1-2,6%, y su número máximo se detecta entre las células hematopoyéticas del hígado embrionario - 0,2-12,5 y 2,3-35,8%, respectivamente.

Sin embargo, la calidad del material trasplantado depende no solo del número de células CD34+ que contiene, sino también de su actividad funcional, que puede evaluarse por el nivel de formación de colonias in vivo (repoblación de médula ósea en animales letalmente irradiados) e in vitro, por crecimiento de colonias en medios semilíquidos. Resultó que la actividad formadora de colonias y proliferativa de las células progenitoras hematopoyéticas con el fenotipo CD34+CD38 HLA-DR aisladas del hígado embrionario, la médula ósea fetal y la sangre del cordón umbilical supera significativamente el potencial proliferativo y formador de colonias de las células hematopoyéticas de la médula ósea y la sangre periférica de un adulto. El análisis cuantitativo y cualitativo de las HSC de diversos orígenes reveló diferencias significativas tanto en su contenido relativo en la suspensión celular como en sus capacidades funcionales. El número máximo de células CD34+ (24,6%) se encontró en el material trasplantado obtenido de la médula ósea fetal. La médula ósea de un adulto contiene un 2,1% de elementos celulares CD34-positivos. Entre las células mononucleares de la sangre periférica de un adulto, solo el 0,5 % presenta el fenotipo CD34+, mientras que en la sangre del cordón umbilical su número alcanza el 2 %. Al mismo tiempo, la capacidad de formación de colonias de las células CD34+ de la médula ósea fetal es 2,7 veces mayor que la capacidad de crecimiento clonal de las células hematopoyéticas de la médula ósea de un adulto, y las células de la sangre del cordón umbilical forman significativamente más colonias que los elementos hematopoyéticos aislados de la sangre periférica de adultos: 65,5 y 40,8 colonias/10⁻¹ células, respectivamente.

Las diferencias en la actividad proliferativa y la capacidad de formación de colonias de las células madre hematopoyéticas se asocian no solo con los distintos grados de madurez, sino también con su microambiente natural. Se sabe que la intensidad de la proliferación y la tasa de diferenciación de las células madre están determinadas por el efecto regulador integral de un sistema multicomponente de factores de crecimiento y citocinas, producidos tanto por las propias células madre como por los elementos celulares de su microambiente matriz-estromal. El uso de poblaciones celulares purificadas y medios sin suero para el cultivo celular permitió caracterizar factores de crecimiento con efectos estimulantes e inhibidores sobre células madre de diversos niveles, células progenitoras y células comprometidas en una u otra dirección lineal. Los resultados de los estudios indican de forma convincente que las HSC obtenidas de fuentes con diferentes niveles de desarrollo ontogenético difieren tanto fenotípica como funcionalmente. Las HSC en etapas tempranas de la ontogénesis se caracterizan por un alto potencial de autorreproducción y una alta actividad proliferativa. Estas células se distinguen por telómeros más largos y se comprometen para formar todas las líneas celulares hematopoyéticas. La respuesta del sistema inmunitario a las HSC de origen embrionario se retrasa, ya que estas células expresan débilmente moléculas HLA. Existe una clara gradación del contenido relativo de HSC, su capacidad de autorrenovación y el número de tipos de líneas de compromiso que forman: células CD34+ de hígado embrionario > células CD34+ de sangre de cordón umbilical > células CD34+ de médula ósea. Es importante destacar que estas diferencias son inherentes no solo a los períodos intranatal, neonatal y postnatal temprano del desarrollo humano, sino también a toda la ontogénesis: la actividad proliferativa y formadora de colonias de las HSC obtenidas de la médula ósea o sangre periférica de un adulto es inversamente proporcional a la edad del donante.