Células madre mesenquimales

Entre las células madre regionales, las células madre mesenquimales (MSC) ocupan un lugar especial, cuyos derivados constituyen la matriz estromal de todos los órganos y tejidos del cuerpo humano. La prioridad en la investigación de las MSC recae en los representantes de la ciencia biológica rusa.

A mediados del siglo pasado, se aisló por primera vez un cultivo homogéneo de células madre estromales multipotentes de médula ósea en el laboratorio de A. Friedenstein. Las células madre mesenquimales unidas al sustrato mantuvieron una alta intensidad de proliferación durante un largo periodo, y en cultivos con baja densidad de siembra, tras la fijación al sustrato, formaron clones de células similares a fibroblastos sin actividad fagocítica. El cese de la proliferación de las MSC culminó con su diferenciación espontánea in vitro en células de hueso, grasa, cartílago, músculo o tejido conectivo. Estudios posteriores permitieron establecer el potencial osteogénico de las células similares a fibroblastos del estroma de la médula ósea de diversas especies de mamíferos, así como su actividad formadora de colonias. Experimentos in vivo han demostrado que el trasplante heterotópico y ortotópico de células similares a fibroblastos formadoras de colonias da lugar a la formación de hueso, cartílago, tejido fibroso y adiposo. Dado que las células madre del estroma de la médula ósea se caracterizan por una alta capacidad de autorrenovación y diferenciación multifacética dentro de una sola línea celular, se denominan células progenitoras mesenquimales multipotentes.

Cabe destacar que a lo largo de 45 años de investigación fundamental sobre células madre mesenquimales se han creado las condiciones reales para el uso de sus derivados en la práctica clínica.

Hoy en día, no cabe duda de que todos los tejidos del cuerpo humano se forman a partir de células madre de diversas líneas celulares como resultado de los procesos de proliferación, migración, diferenciación y maduración. Sin embargo, hasta hace poco se creía que las células madre en un organismo adulto eran específicas de cada tejido, es decir, capaces de producir líneas de células especializadas solo de aquellos tejidos en los que se encuentran. Esta postura conceptual fue refutada por los hechos de la transformación de células madre hematopoyéticas no solo en elementos celulares de sangre periférica, sino también en células ovales del hígado. Además, se demostró que las células madre neurales son capaces de dar lugar tanto a neuronas como a elementos gliales, así como a líneas tempranas comprometidas de células progenitoras hematopoyéticas. A su vez, las células madre mesenquimales, que suelen producir elementos celulares de hueso, cartílago y tejido adiposo, son capaces de transformarse en células madre neurales. Se supone que, en el proceso de crecimiento, regeneración tisular fisiológica y reparadora, se generan células progenitoras no comprometidas a partir de reservas madre no específicas de tejido. Por ejemplo, la reparación del tejido muscular puede lograrse gracias a la migración de células madre mesenquimales desde la médula ósea a los músculos esqueléticos.

Aunque no todos los investigadores reconocen esta intercambiabilidad de células madre, la posibilidad del uso clínico de células madre mesenquimales como fuente de trasplante celular y vector celular de información genética ya no es cuestionada, al igual que la multipotencia de las células madre estromales de la médula ósea, que pueden aislarse y expandirse con relativa facilidad en cultivos in vitro. Al mismo tiempo, siguen apareciendo en la literatura científica informes sobre la posible pluripotencia de las células madre estromales de la médula ósea. Como prueba, se citan protocolos de investigación en los que, bajo la influencia de inductores específicos de transdiferenciación, las MSC se transforman en células nerviosas, cardiomiocitos y hepatocitos. Sin embargo, algunos científicos tienen serias dudas sobre la posibilidad de activación y expresión repetidas de genes del período de embriogénesis temprana. Al mismo tiempo, todos comprenden que si se encuentran las condiciones para expandir la multipotencia de las células madre mesenquimales a la pluripotencia de las ESC, se resolverán automáticamente muchos problemas éticos, morales, religiosos y legales en la medicina plástica regenerativa. Además, dado que en este caso la fuente de potencial regenerativo son las células madre autólogas del estroma del paciente, también se soluciona el problema del rechazo inmunitario al trasplante celular. El futuro próximo demostrará cuán realistas son estas perspectivas.

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Uso de células madre mesenquimales en medicina

En la clínica, el uso de derivados de células madre mesenquimales se asocia principalmente a la restauración de defectos tisulares que se producen en lesiones cutáneas térmicas extensas y profundas. En la fase preclínica, se realizó una evaluación experimental de la viabilidad del uso de células madre mesenquimales alogénicas tipo fibroblastos para el tratamiento de quemaduras profundas. Se demostró que las células madre mesenquimales tipo fibroblastos de médula ósea forman una monocapa en cultivo, lo que permite su trasplante para optimizar los procesos de regeneración de las quemaduras profundas. Los autores señalan que los fibroblastos embrionarios tienen una propiedad similar, pero su uso clínico está limitado por problemas éticos y legales existentes. Se modeló una quemadura térmica profunda con daño en todas las capas de la piel en ratas Wistar. El área de la quemadura representó entre el 18 % y el 20 % de la superficie total de la piel. El primer grupo experimental incluyó ratas con quemadura térmica profunda y trasplante de células madre mesenquimales alogénicas tipo fibroblastos. El segundo grupo consistió en animales con quemadura térmica profunda y trasplante de fibroblastos embrionarios alogénicos. El tercer grupo estuvo representado por ratas control con una quemadura térmica profunda que no se sometieron a terapia celular. Se aplicó una suspensión de células madre mesenquimales similares a fibroblastos y fibroblastos embrionarios a la superficie de la quemadura con una pipeta en una cantidad de 2 x 10⁻¹ ^.células al segundo día tras el modelado de la quemadura y la escisión de la costra necrótica resultante. Tras el trasplante celular, la superficie de la quemadura se cubrió con una gasa humedecida con solución isotónica de cloruro de sodio con gentamicina. Se recolectaron células de la médula ósea para obtener MSC con su posterior inducción en una línea de células madre mesenquimales similares a fibroblastos de ratas Wistar adultas a partir de fémures. Los fibroblastos embrionarios se obtuvieron de los pulmones de embriones de 14 a 17 días de edad. Los fibroblastos embrionarios y las células de la médula ósea para obtener MSC se cultivaron preliminarmente en placas de Petri a una temperatura de 37 °C en una incubadora de CO2, en una atmósfera con un 5 % de CO2 y una humedad del 95 %. Los fibroblastos embrionarios se cultivaron durante 4 a 6 días, mientras que la formación de una monocapa de MSC requirió de 14 a 17 días. Posteriormente, las MSC se criopreservaron como material de partida para las células madre mesenquimales similares a fibroblastos, obtenidas mediante descongelación y cultivo durante 4 días. El número de células madre mesenquimales similares a fibroblastos formadas fue más del triple que el de fibroblastos embrionarios formados durante el mismo período de cultivo. Para identificar las células trasplantadas en las heridas por quemaduras durante el cultivo, se marcó su genoma utilizando un vector lanzadera viral basado en el adenovirus recombinante tipo V, portador del gen 1ac-2, que codifica la ß-galactosidasa de E. coli. Se detectaron células vivas en diferentes momentos tras el trasplante mediante inmunohistoquímica en criosecciones con la adición del sustrato X-Gal, que produce una tinción azul-verde característica. Como resultado de la evaluación visual, planimétrica e histológica dinámica del estado de la herida por quemaduras, se estableció que, ya al tercer día tras el trasplante celular, se observaban diferencias significativas en el curso del proceso de la herida en los grupos seleccionados. Esta diferencia se hizo especialmente evidente al séptimo día tras el trasplante celular. En los animales del primer grupo, a los que se trasplantaron células madre mesenquimales similares a fibroblastos, la herida adquirió un color rosa intenso uniforme, el tejido de granulación creció en toda su superficie hasta la epidermis y la superficie de la quemadura disminuyó significativamente de tamaño. La película de colágeno formada en la superficie de la herida se volvió algo más delgada, pero continuó cubriendo toda el área de la quemadura. En los animales del segundo grupo, a los que se trasplantaron fibroblastos embrionarios, el tejido de granulación se elevó hasta la epidermis de los bordes de la herida, pero solo en algunos lugares, mientras que la plasmorrea de la herida fue más intensa que en el primer grupo y la película de colágeno formada inicialmente prácticamente desapareció. En los animales que no recibieron terapia celular, al séptimo día, la herida de la quemadura presentaba un tejido pálido, con hoyuelos y necrótico cubierto de fibrina. Se observó plasmórea en toda la superficie de la quemadura. Histológicamente, los animales del primer y segundo grupo mostraron una disminución de la infiltración celular y del desarrollo de la red vascular.y estos signos del proceso regenerativo incipiente fueron más pronunciados en las ratas del primer grupo. En el grupo control, se observaron signos de infiltración celular de la herida, el patrón histológico de los vasos neoformados estaba ausente. En el día 15-30 de observación, el área de la superficie de la quemadura en los animales del primer grupo fue significativamente menor que en las ratas de los otros grupos, y la superficie de granulación estaba más desarrollada. En los animales del segundo grupo, el área de la superficie de la quemadura también disminuyó en comparación con el tamaño de las heridas por quemaduras en las ratas del grupo control, lo que ocurrió debido a la epitelización marginal. En el grupo control, la superficie de la quemadura permaneció pálida en lugares con granulaciones raras, aparecieron asteriscos vasculares en ella, había islotes de placa fibrinosa, la plasmorrea moderada continuó sobre toda la superficie de la quemadura y una costra que era difícil de separar permaneció en algunos lugares. En general, en los animales del tercer grupo, el tamaño de la herida también disminuyó, pero los bordes de la herida permanecieron socavados.

Así, durante un estudio comparativo de la tasa de cicatrización de heridas utilizando células madre mesenquimales similares a fibroblastos y fibroblastos embrionarios, así como sin el uso de terapia celular, se observó una aceleración de la tasa de cicatrización de la superficie de la quemadura como resultado del trasplante de células madre mesenquimales similares a fibroblastos y fibroblastos embrionarios. Sin embargo, en el caso del uso de células madre mesenquimales similares a fibroblastos alogénicas, la tasa de cicatrización de la herida fue mayor que con el trasplante de fibroblastos embrionarios. Esto se reflejó en la aceleración del cambio de fases del proceso regenerativo: se redujeron los plazos de infiltración celular, aumentó la tasa de crecimiento de la red vascular y se formó tejido de granulación.

Los resultados de la planimetría dinámica indican que la tasa de curación espontánea de la herida por quemadura (sin el uso de terapia celular) fue la más baja. En los días 15 y 30 posteriores al trasplante de células madre mesenquimales similares a fibroblastos alogénicas, la tasa de curación de la herida fue mayor que con el trasplante de fibroblastos embrionarios. El método histoquímico para detectar beta-galactosidasa mostró que después del trasplante de células madre mesenquimales similares a fibroblastos y fibroblastos embrionarios, las células trasplantadas permanecen viables en la superficie y en la profundidad de las heridas en regeneración durante todo el período de observación. Los autores creen que la mayor tasa de regeneración de la herida por quemadura con el uso de células madre mesenquimales similares a fibroblastos se debe a la liberación de factores estimulantes del crecimiento biológicamente activos por estas células durante el proceso de maduración.

El trasplante de queratinocitos autólogos o alogénicos y fibroblastos alogénicos para el tratamiento de quemaduras también se ha utilizado en la práctica clínica. Cabe destacar que el tratamiento quirúrgico de niños con quemaduras profundas extensas es complejo debido a su alto grado de traumatismo, las múltiples intervenciones quirúrgicas, la pérdida significativa de sangre y las diversas reacciones a los medios de infusión utilizados. Las principales dificultades para realizar cirugías plásticas cutáneas en quemaduras profundas extensas, con una superficie superior al 40% de la superficie corporal, se deben a la gravedad de las víctimas y a la falta de donantes de piel. El uso de trasplantes de malla con un alto coeficiente de perforación no soluciona el problema, ya que las células formadas tras la perforación se epitelizan muy lentamente y los propios colgajos de piel a menudo se lisan o se secan. Los recubrimientos de quemaduras como la xenopiel, los aloinjertos de cadáver y las películas sintéticas no siempre son lo suficientemente eficaces, por lo que se están desarrollando nuevos métodos para cubrir las superficies de las quemaduras con capas de queratinocitos y fibroblastos cultivados. En particular, se ha propuesto un método para cubrir superficies de quemaduras con la ayuda de alofibroblastos cultivados, que, cuando se trasplantan, tienen un pronunciado efecto estimulante en la proliferación de epidermocitos conservados en la herida en quemaduras limítrofes, así como de queratinocitos en los septos de los trasplantes de malla. El trabajo de L. Budkevich y coautores (2000) presenta los resultados del uso de este método para tratar quemaduras en niños. El estudio incluyó a 31 niños con traumatismo térmico de 1 a 14 años de edad. En tres niños, el área total de las heridas por quemaduras de grados IIIA-B - IV fue del 40%, en 25 - 50-70%, en otros tres - 71-85% de la superficie corporal. La necrectomía quirúrgica temprana se combinó con el trasplante de alofibroblastos cultivados y la autodermoplastia. La primera etapa del tratamiento consistió en la escisión de los tejidos necróticos, la segunda etapa consistió en el trasplante de alofibroblastos cultivados en películas portadoras y la tercera etapa (48 horas después del trasplante de alofibroblastos cultivados) consistió en la remoción de la matriz y autodermoplastia con colgajos de piel con una relación de perforación de 1:4. Tres pacientes ingresados en la clínica con enfermedad por quemaduras graves tenían alofibroblastos cultivados trasplantados en heridas de granulación. El trasplante de alofibroblastos cultivados se realizó una vez en 18 niños, dos veces en 11 niños y tres veces en dos pacientes. El área de la superficie de la herida cubierta con cultivo celular osciló entre 30 y 3500 cm2. La efectividad de los alofibroblastos cultivados se evaluó mediante el porcentaje general de injerto de piel, los tiempos de curación de las quemaduras y el número de muertes por traumatismo térmico grave. El injerto se completó en el 86% de los pacientes. Se observó una falta parcial de injerto de piel en el 14% de los casos. A pesar del tratamiento, seis niños (19,3%) fallecieron. El área total de daño cutáneo en ellos osciló entre el 40% y el 70% de la superficie corporal.El trasplante de alofibroblastos cultivados no se asoció con mortalidad por quemaduras en ningún paciente.

Analizando los resultados del tratamiento, los autores señalan que previamente el daño térmico profundo de la piel que cubría el 35-40% de la superficie corporal se consideraba incompatible con la vida (para niños más pequeños, hasta 3 años de edad, las quemaduras profundas que cubren el 30% de la superficie corporal son críticas, para niños mayores, más del 40% de la superficie corporal). Cuando se realiza la necrectomía quirúrgica con trasplante de alofibroblastos cultivados y la posterior autodermoplastia con colgajos de piel con un alto coeficiente de perforación, las quemaduras de grado IIIB - IV siguen siendo críticas, pero en la actualidad existen perspectivas de salvar las vidas incluso de esas víctimas en muchos casos. La necrectomía quirúrgica en combinación con el trasplante de alofibroblastos cultivados y la autodermoplastia en niños con quemaduras profundas ha demostrado ser especialmente efectiva en pacientes con lesiones cutáneas generalizadas con escasez de sitios donantes. Las tácticas quirúrgicas activas y el trasplante de alofibroblastos cultivados contribuyen a la rápida estabilización del estado general de estos pacientes, a la disminución de las complicaciones infecciosas de las quemaduras, a la creación de condiciones favorables para la implantación de los trasplantes, a la reducción del tiempo de recuperación de la piel perdida y de la duración del tratamiento hospitalario, y a la disminución de la frecuencia de desenlaces fatales en víctimas con quemaduras extensas. Por lo tanto, el trasplante de alofibroblastos cultivados, seguido de una autodermoplastia con colgajos de piel, permite la recuperación de niños con quemaduras graves, que antes se consideraban condenados.

Se acepta generalmente que el objetivo principal del tratamiento de las quemaduras es la restauración completa y rápida de la piel dañada para prevenir efectos tóxicos, complicaciones infecciosas y deshidratación. Los resultados del uso de células cultivadas dependen en gran medida de la preparación de la herida para el trasplante. En casos de trasplante de queratinocitos cultivados a la superficie de la herida tras una necrectomía quirúrgica, un promedio del 55% (por área) de las células trasplantadas se injertan, mientras que en las heridas de granulación la tasa de injerto disminuye al 15%. Por lo tanto, el tratamiento exitoso de quemaduras cutáneas profundas y extensas requiere, en primer lugar, tácticas quirúrgicas activas. En presencia de quemaduras de grado IIIB-IV, la superficie quemada se libera inmediatamente del tejido necrótico para reducir la intoxicación y el número de complicaciones. El uso de estas tácticas es clave para reducir el tiempo desde la quemadura hasta la cicatrización de las heridas y la duración de la estancia hospitalaria de los pacientes con quemaduras extensas, además de reducir significativamente el número de desenlaces fatales.

Los primeros informes sobre el uso exitoso de queratinocitos cultivados para cubrir superficies quemadas aparecieron a principios de la década de 1980. Posteriormente, esta manipulación se realizó utilizando capas de queratinocitos cultivados, obtenidos con mayor frecuencia de autocélulas y, con mucha menor frecuencia, de aloqueratinocitos. Sin embargo, la tecnología de la autoqueratinocitoplastia no permite la creación de un banco de células, y el tiempo necesario para producir un trasplante de queratinocitos de un área suficiente es largo, de 3 a 4 semanas. Durante este período, el riesgo de desarrollar infecciones y otras complicaciones de la enfermedad por quemaduras aumenta considerablemente, lo que prolonga significativamente la estancia hospitalaria de los pacientes. Además, los autoqueratinocitos prácticamente no arraigan al trasplantarse sobre heridas de quemaduras con granulación, y el alto coste de los medios de crecimiento especiales y de los estimuladores biológicamente activos del crecimiento de queratinocitos limita significativamente su uso clínico. Otros métodos biotecnológicos, como la colagenoplastia, el trasplante de xenoskin criopreservado y el uso de diversos recubrimientos de biopolímeros, aumentan la eficacia del tratamiento de quemaduras superficiales extensas, pero no profundas. El método de cubrir la superficie de la herida con fibroblastos cultivados es fundamentalmente diferente, ya que se utilizan fibroblastos, en lugar de queratinocitos, como componente principal de la capa celular cultivada.

El requisito previo para el desarrollo del método fue el hecho de que los pericitos que rodean los vasos pequeños son células mesenquimales progenitoras capaces de transformarse en fibroblastos, que producen numerosos factores de crecimiento y aseguran la cicatrización de heridas gracias a un fuerte efecto estimulante sobre la proliferación y adhesión de los queratinocitos. El uso de fibroblastos cultivados para cerrar las superficies de las heridas reveló de inmediato una serie de ventajas significativas de este método en comparación con el uso de queratinocitos cultivados. En particular, la obtención de fibroblastos en cultivo no requiere el uso de medios nutritivos especiales ni estimulantes del crecimiento, lo que reduce el coste del trasplante más de 10 veces en comparación con el coste de la obtención de queratinocitos. Los fibroblastos se pasivan fácilmente, durante lo cual pierden parcialmente los antígenos de histocompatibilidad de superficie, lo que a su vez abre la posibilidad de utilizar células alogénicas para la fabricación de trasplantes y la creación de bancos de células. El tiempo necesario para obtener trasplantes listos para su uso en la clínica se reduce de 3 semanas (para queratinocitos) a 1-2 días (para fibroblastos). Se puede obtener un cultivo primario de fibroblastos cultivando células de fragmentos de piel tomados durante la autodermoplastia, y la densidad de siembra de células para obtener subcultivos de fibroblastos humanos es de solo 20 x 10 ³ por 1 cm ².

Para estudiar el efecto de los fibroblastos y sus proteínas reguladoras en la proliferación y diferenciación de los queratinocitos, se realizó un análisis comparativo de la morfología y proliferación de los queratinocitos en sustratos de colágeno tipos I y III, así como fibronectina en un cultivo conjunto con fibroblastos humanos. Los queratinocitos humanos se aislaron de fragmentos de piel de pacientes con quemaduras, tomados durante la autodermoplastia. La densidad de siembra de queratinocitos fue de 50 x 103 células por 1 cm2. La eficacia clínica del trasplante de fibroblastos cultivados se evaluó en 517 pacientes. Todos los pacientes se dividieron en dos grupos: Grupo 1: víctimas adultas con quemaduras de grado IIA, B - IV; Grupo 2: niños con quemaduras profundas de grado IIIB - IV. La evaluación de la dinámica de la organización estructural y funcional de fibroblastos en cultivos monocapa, considerando el papel de los glicosaminoglicanos, la fibronectina y el colágeno en los procesos de regeneración, permitió a los autores determinar el tercer día como el período más favorable para el uso de cultivos de fibroblastos en trasplantes. Un estudio del efecto de los fibroblastos en la proliferación y diferenciación de los queratinocitos mostró que, in vitro, los fibroblastos tienen un marcado efecto estimulante, principalmente en los procesos de adhesión de los queratinocitos, aumentando el número de células adheridas y su velocidad de fijación en más del doble. La estimulación de los procesos de adhesión se acompaña de un aumento en la intensidad de la síntesis de ADN y en el nivel de proliferación de queratinocitos. Además, se demostró que la presencia de fibroblastos y la matriz extracelular que estos forman es una condición necesaria para la formación del aparato tonofibrilar de los queratinocitos, las conexiones intercelulares y, en última instancia, para la diferenciación de los queratinocitos y la formación de la membrana basal. En el tratamiento de niños con quemaduras profundas, se ha demostrado una alta eficiencia clínica del trasplante de alofibroblastos, especialmente en pacientes con lesiones cutáneas extensas y deficiencia de la zona donante. Un estudio morfofuncional exhaustivo ha demostrado que los fibroblastos trasplantados se caracterizan por una síntesis activa de ADN, así como de colágeno, fibronectina y glicosaminoglicanos, que forman parte de la matriz extracelular. Los autores destacan un alto porcentaje de injerto de fibroblastos trasplantados (hasta un 96%), una marcada reducción del tiempo de obtención (en 24-48 horas en lugar de 2-3 semanas con queratinocitos), una aceleración significativa de la epitelización de la superficie quemada y una reducción significativa (10 veces) del coste de la tecnología para el cultivo de fibroblastos en comparación con el trasplante de queratinocitos. El uso del trasplante de alofibroblastos cultivados permite salvar la vida de niños con quemaduras críticas (daño térmico en más del 50% de la superficie corporal).Lo cual anteriormente se consideraba incompatible con la vida. Cabe destacar que, con el trasplante de fibroblastos embrionarios alogénicos, se ha demostrado de forma convincente no solo una regeneración más rápida de las heridas y la convalecencia de pacientes con quemaduras de diversos grados y zonas, sino también una reducción significativa de su mortalidad.

Los fibroblastos autólogos también se utilizan en un área compleja de la cirugía plástica como la corrección reconstructiva de lesiones de las cuerdas vocales. Para este fin, se suele emplear colágeno bovino, cuya duración de acción está limitada por su inmunogenicidad. Al ser una proteína extraña, el colágeno bovino es sensible a la colagenasa del receptor y puede provocar reacciones inmunitarias. Para reducir este riesgo, se desarrollaron tecnologías para obtener preparaciones de colágeno reticulado con glutaraldehído. Su ventaja reside en una mayor estabilidad y una menor inmunogenicidad, lo que ha encontrado aplicación práctica en la corrección de defectos y atrofia de las cuerdas vocales. Las inyecciones de colágeno autólogo se utilizaron por primera vez en 1995. Esta técnica garantizó la preservación de la estructura primaria de las fibras de colágeno autólogo, incluyendo los enlaces cruzados intramoleculares catalizados enzimáticamente. De hecho, las fibras de colágeno natural son más resistentes a la destrucción por proteasas que el colágeno reconstituido, en el que se cortan los telopéptidos. La integridad de los telopéptidos es importante para la estructura cuaternaria de las fibras de colágeno y la formación de enlaces cruzados entre moléculas de colágeno adyacentes. A diferencia de las preparaciones de colágeno bovino, el colágeno autólogo no provoca reacciones inmunitarias en el receptor, pero no es lo suficientemente eficaz como agente de reposición. Se puede lograr una corrección estable mediante la producción local de colágeno mediante el trasplante de fibroblastos autólogos. Sin embargo, se identificaron ciertas dificultades durante el estudio de la eficacia del trasplante de fibroblastos autólogos en la clínica. En el período inicial tras el trasplante de fibroblastos, el efecto clínico fue menor en comparación con el observado tras la introducción de colágeno bovino. Al cultivar fibroblastos autólogos, no se puede descartar la posibilidad de transformación de fibroblastos normales en patológicos, los denominados miofibroblastos, responsables del desarrollo de la fibrosis y la formación de cicatrices, como lo demuestra la contracción del gel de colágeno causada por la interacción específica de fibroblastos y fibrillas de colágeno. Además, después del pasaje seriado in vitro, los fibroblastos pierden la capacidad de sintetizar proteínas de la matriz extracelular.

Sin embargo, ahora se ha desarrollado experimentalmente un método para cultivar fibroblastos humanos autólogos que elimina las deficiencias mencionadas anteriormente y no resulta en la transformación oncogénica de fibroblastos normales. Los fibroblastos autólogos obtenidos mediante este método se utilizan para restaurar defectos en tejidos faciales blandos. En un estudio de G. Keller et al. (2000), se trataron 20 pacientes de 37 a 61 años con arrugas y cicatrices atróficas. Las biopsias de piel (4 mm) de la región retroauricular se transportaron al laboratorio en tubos de ensayo estériles que contenían 10 ml de medio de cultivo (medio de Eagle con antibiótico, micoséptico, piruvato y suero fetal bovino). El material se colocó dentro de 3-5 placas de cultivo de 60 mm de diámetro y se incubaron en un termostato con una atmósfera que contenía 5% de CO2. Después de 1 semana, las células se retiraron de las placas mediante tripsinización y se colocaron en viales de 25 cm2. Las células se inyectaron en pacientes en una cantidad de 4 x 10⁻¹. Se observó un efecto clínico significativo y persistente en pacientes durante la corrección de los pliegues nasolabiales, así como en pacientes con cicatrices 7 y 12 meses después del tercer trasplante de fibroblastos autólogos. Según la citometría de flujo, los fibroblastos cultivados produjeron una gran cantidad de colágeno tipo I. Estudios in vitro han demostrado una contractilidad normal de los fibroblastos inyectados. Dos meses después de la administración subcutánea de fibroblastos cultivados a una dosis de 4 x 10⁻¹ células, no se detectaron tumores en ratones desnudos. Los fibroblastos inyectados no causaron cicatrices ni fibrosis difusa en los pacientes. Según el autor, los fibroblastos autólogos injertados son capaces de producir colágeno de forma constante, lo que proporcionará un efecto de rejuvenecimiento cosmético. Al mismo tiempo, dado que la vida útil de las células diferenciadas es limitada, los fibroblastos extraídos de un paciente joven son más eficaces que los obtenidos de personas mayores. En el futuro, se supone que será posible criopreservar un cultivo de fibroblastos de un donante joven para posteriormente trasplantar sus propias células jóvenes a un paciente de edad avanzada. En conclusión, no es del todo correcto concluir que los fibroblastos autólogos, siempre que se conserven funcionalmente, sean un método ideal para corregir defectos en los tejidos blandos faciales. Al mismo tiempo, el propio autor señala que durante el estudio surgieron algunas situaciones problemáticas relacionadas con el uso del sistema fibroblasto-colágeno autólogo. El efecto clínico fue a menudo menor que con el colágeno bovino, lo que causó decepción en los pacientes.

En general, la información bibliográfica sobre las perspectivas del uso clínico de células madre mesenquimales es bastante optimista. Se está intentando utilizar células progenitoras mesenquimales multipotentes de médula ósea autóloga para tratar lesiones articulares degenerativas. Se están llevando a cabo los primeros ensayos clínicos sobre el uso de células progenitoras mesenquimales cultivadas en el tratamiento de fracturas óseas complejas. Las células estromales mesenquimales de médula ósea, tanto alogénicas como autogénicas, se utilizan para crear tejido cartilaginoso para trasplantes en la corrección de defectos del cartílago articular debidos a traumatismos o lesiones autoinmunes. Se están desarrollando métodos para el uso clínico de células progenitoras mesenquimales multipotentes para eliminar defectos óseos en niños con una forma grave de osteogénesis incompleta causada por mutaciones en el gen del colágeno tipo I. Tras la mieloablación, los niños receptores reciben un trasplante de médula ósea de donantes sanos compatibles con HLA, ya que la médula ósea no fraccionada puede contener una cantidad suficiente de células madre mesenquimales para compensar un defecto óseo grave. Tras el trasplante de médula ósea alogénica, estos niños han mostrado cambios histológicos positivos en el hueso trabecular, un aumento de la tasa de crecimiento y una disminución de la incidencia de fracturas óseas. En algunos casos, se logra un resultado clínico positivo mediante el trasplante de médula ósea alogénica y osteoblastos estrechamente relacionados. El trasplante de células madre mesenquimales (CMM) también se utiliza para tratar la fragilidad ósea congénita causada por un desequilibrio de osteoblastos y osteoclastos en el tejido óseo. En este caso, la restauración de la formación ósea se logra mediante la quimerización del conjunto de células madre y progenitoras del estroma en el tejido óseo de los pacientes.

Se continúa mejorando los métodos de modificación genética de células madre mesenquimales de donantes para corregir defectos genéticos en los tejidos del estroma. Se prevé que, en un futuro próximo, las células progenitoras mesenquimales se utilizarán en neurología para la quimerización dirigida de células cerebrales y la creación de un conjunto de células sanas capaces de generar enzimas o factores deficientes responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad. El trasplante de células madre mesenquimales puede utilizarse para la restauración del estroma de la médula ósea en pacientes con cáncer tras radioterapia y quimioterapia, y, en combinación con células de la médula ósea, para la restauración de la hematopoyesis. El desarrollo de terapias de reemplazo dirigidas a la eliminación de defectos del sistema musculoesquelético con la ayuda de MSC se ve impulsado por los avances en ingeniería en el campo del diseño de biomateriales matriciales o biomiméticos que forman estructuras pobladas por la progenie de células madre mesenquimales.

Fuentes de células madre mesenquimales

La principal fuente de células madre mesenquimales es la médula ósea, cuyas células madre hematopoyéticas en el cuerpo de los mamíferos se diferencian constantemente en células sanguíneas y del sistema inmunitario. Mientras que las células madre mesenquimales están representadas por una pequeña población de células similares a fibroblastos del estroma de la médula ósea y contribuyen a la preservación del estado indiferenciado de las células madre hematopoyéticas. Bajo ciertas condiciones, las células madre mesenquimales se diferencian en células de cartílago y tejido óseo. Cuando se siembran en un medio de cultivo en condiciones de siembra de baja densidad, las células estromales mononucleares de la médula ósea forman colonias de células adhesivas, que son, de hecho, células progenitoras mesenquimales multipotentes similares a fibroblastos. Algunos autores creen que las células madre mesenquimales no comprometidas se depositan en la médula ósea, la cual, debido a su capacidad de autorrenovación y alto potencial de diferenciación, proporciona a todos los tejidos del cuerpo precursores mesenquimales de elementos estromales a lo largo de la vida del organismo mamífero.

En la médula ósea, los elementos celulares del estroma forman una red que llena el espacio entre los sinusoides y el tejido óseo. El contenido de MSC latentes en la médula ósea de un adulto es comparable a la cantidad de células madre hematopoyéticas y no supera el 0,01-0,001 %. Las células madre mesenquimales aisladas de la médula ósea y no sometidas a cultivo carecen de moléculas de adhesión. Dichas MSC no expresan CD34, ICAM, VCAM, colágeno tipos I y III, CD44 y CD29. En consecuencia, in vitro, no son células madre mesenquimales las que se fijan al sustrato de cultivo, sino derivados progenitores más avanzados de células madre mesenquimales que ya han formado los componentes del citoesqueleto y el aparato receptor de las moléculas de adhesión celular. Las células estromales con el fenotipo CD34 se encuentran incluso en sangre periférica, aunque en la médula ósea hay significativamente menos de ellas que las células mononucleares CD34-positivas. Las células CD34 aisladas de la sangre y transferidas al cultivo se unen al sustrato y forman colonias de células similares a fibroblastos.

Se sabe que, en el período embrionario, la base estromal de todos los órganos y tejidos de mamíferos y humanos surge de un conjunto común de células madre mesenquimales antes y durante la organogénesis. Por lo tanto, se cree que, en un organismo maduro, la mayoría de las células madre mesenquimales deberían estar en el tejido conectivo y óseo. Se ha establecido que la mayor parte de los elementos celulares del estroma del tejido conectivo y óseo laxo está representada por células progenitoras comprometidas, que, sin embargo, conservan la capacidad de proliferar y formar clones in vitro. Cuando estas células se introducen en el torrente sanguíneo general, más del 20 % de las células progenitoras mesenquimales se implantan entre los elementos estromales del tejido hematopoyético y los órganos parenquimatosos.

Una fuente potencial de células madre mesenquimales es el tejido adiposo, entre cuyas células madre se han identificado precursores de adipocitos comprometidos en diversos grados. Los elementos progenitores menos maduros del tejido adiposo son las células estromales vasculares, que, al igual que las células precursoras mesenquimales multipotentes de la médula ósea, son capaces de diferenciarse en adipocitos bajo la influencia de glucocorticoides, factor de crecimiento similar a la insulina e insulina. En cultivo, las células estromales vasculares se diferencian en adipocitos y condrocitos, y en el tejido adiposo de origen medular existen células que forman adipocitos y osteoblastos.

También se han encontrado células madre estromales en músculos. En cultivos primarios de células aisladas de músculo esquelético humano, se detectan células estrelladas y miotubos multinucleados. En presencia de suero de caballo, las células estrelladas proliferan in vitro sin signos de citodiferenciación y, tras la adición de dexametasona al medio nutritivo, su diferenciación se caracteriza por la aparición de elementos celulares con fenotipo de células musculares esqueléticas y lisas, hueso, cartílago y tejido adiposo. Por lo tanto, en el tejido muscular humano existen células progenitoras mesenquimales multipotentes, tanto comprometidas como no comprometidas. Se ha demostrado que la población de células progenitoras presente en el músculo esquelético proviene de células progenitoras mesenquimales multipotentes no comprometidas de la médula ósea y difiere de las células satélite miogénicas.

También se encontraron células estrelladas adhesivas, correspondientes a células progenitoras mesenquimales multipotentes en potencial de diferenciación, en el miocardio de ratas recién nacidas, ya que, bajo la influencia de la dexametasona, se diferencian en adipocitos, osteoblastos, condrocitos, células musculares lisas, miotubos de músculo esquelético y cardiomiocitos. Se demostró que las células musculares lisas vasculares (pericitos) son derivadas de células progenitoras mesenquimales multipotentes perivasculares indiferenciadas. En cultivo, las células madre mesenquimales perivasculares expresan α-actina de músculo liso y el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, y son capaces de diferenciarse, al menos, en células musculares lisas.

Desde el punto de vista de las reservas de células madre, el tejido cartilaginoso ocupa un lugar especial. Se cree que su bajo potencial reparativo se debe a una deficiencia de células progenitoras mesenquimales multipotentes o de factores de diferenciación y crecimiento. Se supone que las células progenitoras mesenquimales multipotentes, prededicadas a la condrogénesis y la osteogénesis, ingresan al tejido cartilaginoso desde otras fuentes tisulares.

Tampoco se han establecido el origen tisular ni las condiciones de adhesión de las células progenitoras mesenquimales a los tendones. Observaciones experimentales indican que, en el período posnatal temprano, las células del tendón de Aquiles de conejo en cultivos primarios y en el primer pase conservan la expresión de colágeno tipo I y decorina, pero con cultivos posteriores pierden los marcadores de diferenciación de los tenocitos.

Cabe señalar que aún no se ha recibido la respuesta a la pregunta de si las células progenitoras mesenquimales multipotentes localizadas en diversos tejidos están realmente presentes de forma constante en su estroma, o si el acervo tisular de células madre mesenquimales se repone mediante la migración de células madre estromales de la médula ósea.

Además de la médula ósea y otras zonas de tejido mesenquimal de un organismo adulto, la sangre del cordón umbilical puede ser otra fuente de MSC. Se ha demostrado que la sangre de la vena del cordón umbilical contiene células que tienen características morfológicas y antigénicas similares a las células progenitoras mesenquimales multipotentes, son capaces de adhesión y no son inferiores a las células progenitoras mesenquimales multipotentes de origen de la médula ósea en potencial de diferenciación. En cultivos de células madre mesenquimales de sangre de cordón umbilical, se encontró del 5 al 10% de células progenitoras mesenquimales multipotentes no comprometidas. Resultó que su número en la sangre del cordón es inversamente proporcional a la edad gestacional, lo que indica indirectamente la migración de células progenitoras mesenquimales multipotentes a diversos tejidos durante el desarrollo fetal. Han aparecido las primeras informaciones sobre el uso clínico de células madre mesenquimales aisladas de la sangre del cordón umbilical, así como de las obtenidas a partir de biomaterial embrionario, que se basa en la capacidad conocida de las células madre fetales de integrarse, injertarse y funcionar en los órganos y sistemas tisulares de los receptores adultos.

Búsqueda de nuevas fuentes de células madre mesenquimales

El uso de células madre mesenquimales de origen embrionario, así como otras células fetales, genera diversos problemas éticos, legales, judiciales y legislativos. Por lo tanto, continúa la búsqueda de material celular extraembrionario de donantes. Un intento de uso clínico de fibroblastos de piel humana resultó infructuoso, lo cual estuvo predeterminado no solo por la alta capacidad financiera de la tecnología, sino también por la rápida diferenciación de los fibroblastos en fibrocitos, que tienen un potencial de proliferación significativamente menor y producen una cantidad limitada de factores de crecimiento. Los avances en el estudio de la biología de las MSC y las células progenitoras mesenquimales multipotentes de la médula ósea permitieron desarrollar una estrategia para el uso clínico de células madre mesenquimales autólogas. La tecnología para su aislamiento, cultivo, reproducción ex vivo y diferenciación dirigida requirió, en primer lugar, el estudio del espectro de marcadores moleculares de las MSC. Su análisis mostró que los cultivos primarios de tejido óseo humano contienen varios tipos de células progenitoras mesenquimales multipotentes. El fenotipo proosteoblástico se detectó en células que expresaban el marcador de células progenitoras estromales STRO-1, pero no portaban el marcador osteoblástico: la fosfatasa alcalina. Estas células se caracterizan por una baja capacidad para formar matriz ósea mineralizada, así como por la ausencia de expresión de osteopontina y del receptor de la hormona paratiroidea. Los derivados de células STRO-1-positivas que no expresan fosfatasa alcalina están representados por osteoblastos de diferenciación intermedia y completa. Se encontró que los elementos celulares de líneas clonadas de células óseas trabeculares humanas STRO-1-positivas son capaces de diferenciarse en osteocitos maduros y adipocitos. La dirección de la diferenciación de estas células depende del efecto de los ácidos grasos poliinsaturados, las citocinas proinflamatorias IL-1β y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), así como del TGF-β, un factor antiinflamatorio e inmunosupresor.

Posteriormente se descubrió que las células progenitoras mesenquimales multipotentes carecen de un fenotipo específico inherente solo a ellas, pero expresan un complejo de marcadores característicos de las células mesenquimales, endoteliales, epiteliales y musculares en ausencia de expresión de antígenos inmunofenotípicos de células hematopoyéticas: CD45, CD34 y CD14. Además, las células madre mesenquimales producen de forma constitutiva e inducible factores de crecimiento hematopoyéticos y no hematopoyéticos, interleucinas y quimiocinas, y los receptores para algunas citocinas y factores de crecimiento se expresan en células progenitoras mesenquimales multipotentes. Se han encontrado células latentes o en reposo con un inmunofenotipo casi idéntico al perfil antigénico de las células progenitoras mesenquimales multipotentes no tratadas con 5-fluorouracilo entre las células de la matriz estromal del cuerpo humano; ambas células expresan CD117, que marca las células madre "adultas".

Por lo tanto, aún no se ha identificado un marcador celular exclusivo de las células madre mesenquimales. Se asume que las células quiescentes representan una población de células progenitoras mesenquimales multipotentes no comprometidas, ya que no expresan marcadores de células comprometidas con la osteogénesis (Cbfa-1) o la adipogénesis (PPAR-y-2). La exposición prolongada de células quiescentes de proliferación lenta al suero bovino fetal conduce a la formación de progenitores comprometidos de diferenciación terminal caracterizados por un crecimiento rápido. La expansión clonal de dichas células madre mesenquimales está respaldada por FGF2. Parece que el genoma de las células madre estromales es bastante "cerrado". Hay informes de la ausencia de diferenciación espontánea en las MSC: sin condiciones especiales para el compromiso, no se transforman ni siquiera en células del linaje mesenquimal.

Para estudiar la estructura poblacional de los derivados de células madre mesenquimales, se busca la presencia de proteínas marcadoras de diferenciación en líneas celulares estromales y cultivos primarios. El análisis clonal in vitro de células formadoras de colonias de médula ósea ha demostrado que el EGF aumenta el tamaño promedio de las colonias y disminuye la expresión clonal de la fosfatasa alcalina cuando se aplica a cultivos primarios, mientras que la adición de hidrocortisona activa la expresión de la fosfatasa alcalina, que es un marcador de la dirección osteogénica de la diferenciación de las MSC. Los anticuerpos monoclonales contra STRO-1 permitieron separar y estudiar la población de células adhesivas positivas para STRO-1 en un sistema heterogéneo de cultivos de Dexter. Se ha determinado un espectro de citocinas que regulan no solo la proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas y linfoides, sino que también participan en la formación, desarrollo y reabsorción de los tejidos esqueléticos a través de mecanismos para-, auto- y endocrinos. La liberación mediada por receptores de mensajeros secundarios como AMPc, diacilglicerol, inositol trifosfato y Ca₂₄ también se utiliza para el análisis de marcadores de diversas categorías de células del tejido estromal que expresan los receptores correspondientes. El uso de anticuerpos monoclonales como marcadores permitió establecer la pertenencia de las células reticulares del estroma de los órganos linfoides a las zonas dependientes de T y B.

Durante algún tiempo, los debates científicos continuaron en torno a la posibilidad del origen de las MSC a partir de una célula madre hematopoyética. De hecho, cuando se explantan suspensiones de células de médula ósea en cultivos monocapa, crecen en ellas colonias discretas de fibroblastos. Sin embargo, se demostró que la presencia de precursores de colonias de fibroblastos y diversos brotes de diferenciación de tejido hematopoyético en la médula ósea no es evidencia de su origen común a partir de una célula madre hematopoyética. Mediante el análisis discriminante de células madre de médula ósea, se estableció que el microambiente durante el trasplante heterotópico de médula ósea no es transferido por las células hematopoyéticas, lo que demuestra la existencia de una población de MSC en la médula ósea que es histogenéticamente independiente de las células hematopoyéticas.

Además, el método de clonación selectiva permitió identificar una nueva categoría de células progenitoras estromales en cultivos monocapa de células de médula ósea, determinar su número y estudiar sus propiedades, potenciales proliferativos y diferenciadores. Resultó que las células estromales similares a fibroblastos proliferan in vitro y forman colonias diploides que, al trasplantarse de nuevo al cuerpo, propician la formación de nuevos órganos hematopoyéticos. Los resultados del estudio de clones individuales indican que entre las células progenitoras estromales existe una población de células que, por su potencial proliferativo y diferenciador, pueden reivindicar el papel de células madre del tejido estromal, histogenéticamente independientes de las células madre hematopoyéticas. Las células de esta población se caracterizan por un crecimiento autosostenido y se diferencian en elementos celulares progenitores del hueso, cartílago y tejido reticular de la médula ósea.

De gran interés son los resultados de los estudios de R. Chailakhyan y coautores (1997-2001), quienes cultivaron células progenitoras estromales de médula ósea de conejos, cobayas y ratones en el medio nutritivo a-MEM con la adición de suero fetal bovino. Los autores realizaron la explantación con una densidad inicial de 2-4 x 103 células de médula ósea por 1 cm2. Se utilizaron células de médula ósea homólogas o heterólogas inactivadas por radiación como nutricionista en una dosis que retuvo el efecto nutricionista pero bloqueó completamente su proliferación. Colonias discretas primarias de fibroblastos de dos semanas de edad se tripsinizaron para obtener cepas monoclonales. Se obtuvo evidencia del origen clonal de las colonias utilizando un marcador cromosómico en cultivos mixtos de médula ósea de cobayas machos y hembras, fotografía time-lapse de cultivos vivos y en cultivos mixtos de médula ósea singénica de ratones CBA y CBAT6T6. El trasplante de una suspensión de células de médula ósea recién aisladas o fibroblastos estromales cultivados in vitro bajo la cápsula renal se realizó en andamios porosos de ivalón o gelatina, así como en matriz ósea esponjosa de conejo inactivada. Para el trasplante de clones en una vaina ósea, se limpiaron los fémures de cobayas de tejido blando y periostio, se recortaron las epífisis y se lavó completamente la médula ósea. El hueso se cortó en fragmentos (3-5 mm), se secó y se irradió a una dosis de 60 Gy. Se colocaron colonias individuales de fibroblastos en las vainas óseas y se implantaron intramuscularmente. Para el trasplante intraperitoneal de fibroblastos estromales cultivados in vitro, se utilizaron cámaras de difusión de los tipos A (V = 0,015 cm³, h = 0,1 mm) y O (V = 0,15 cm³, h = 2 mm).

Al estudiar la dinámica de crecimiento de cepas clonales, R. Chailakhyan et al. (2001) descubrieron que las células individuales que forman colonias de fibroblastos, así como sus descendientes, tienen un enorme potencial proliferativo. Para el décimo pase, el número de fibroblastos en algunas cepas era de 1,2 a 7,2 x 109 ^células. Durante su desarrollo, realizaron hasta 31-34 duplicaciones celulares. En este caso, el trasplante heterotópico de cepas derivadas de médula ósea formadas por precursores estromales de varias docenas de clones resultó en la transferencia del microambiente de la médula ósea y la formación de un nuevo órgano hematopoyético en la zona de trasplante. Los autores plantearon la pregunta de si los clones individuales son capaces de transferir el microambiente de la médula ósea de las células estromales o si para esto se requiere la cooperación de varios precursores estromales clonogénicos diferentes. Y si los clones individuales son capaces de transferir el microambiente, ¿será completo para los tres brotes hematopoyéticos, o diferentes clones proporcionan la formación del microambiente para diferentes brotes hematopoyéticos? Para resolver estos problemas, se desarrolló una tecnología para cultivar células progenitoras estromales en un gel de colágeno, lo que permite que las colonias de fibroblastos cultivadas se eliminen de la superficie para el posterior trasplante heterotópico. Se extirparon clones individuales de fibroblastos estromales cultivados a partir de células de médula ósea de ratones CBA y cobayas junto con un fragmento del recubrimiento de gel y se trasplantaron heterotópicamente: debajo de la cápsula renal de ratones singénicos o en el músculo abdominal de cobayas autólogas. Cuando se trasplantaron en el músculo, las colonias en el gel se colocaron en vainas óseas.

Los autores encontraron que 50-90 días después del trasplante de colonias de fibroblastos de médula ósea, se observó desarrollo de hueso o tejido óseo y hematopoyético en la zona de trasplante en el 20% de los casos. En el 5% de los animales receptores, los focos formados de tejido óseo contenían una cavidad llena de médula ósea. Dentro de los cilindros óseos, dichos focos tenían una forma redondeada y una cápsula construida de tejido óseo con osteocitos y una capa osteoblástica bien desarrollada. La cavidad de la médula ósea contenía tejido reticular con células mieloides y eritroides, cuya relación proporcional no difería de la de la médula ósea normal. En el riñón, el trasplante fue un órgano típico de médula ósea formado durante el trasplante de médula ósea nativa, con la cápsula ósea cubriendo la cavidad de la médula ósea solo desde el lado de la cápsula renal. El tejido hematopoyético incluía elementos mieloides, eritroides y megacariocíticos. El estroma de la cavidad de la médula ósea tenía un sistema sinusal bien desarrollado y contenía células grasas típicas. Al mismo tiempo, se encontró tejido óseo sin signos de hematopoyesis en la zona de trasplante de algunas colonias bajo la cápsula renal. El estudio de los potenciales proliferativos y de diferenciación de clones individuales continuó en cepas de médula ósea monoclonal de conejos, cuyas células se resuspendieron en un medio nutritivo y en una esponja de ivalón separada con una masa de 1-2 mg se trasplantaron bajo la cápsula renal de un donante de médula ósea de conejo. Se sometieron células de 21 cepas monoclonales a dicho autotrasplante. Los resultados se tuvieron en cuenta después de 2-3 meses. Los autores encontraron que en el 14% de los casos, las cepas monoclonales trasplantadas formaron un órgano de médula ósea que consiste en tejido óseo y una cavidad de médula ósea llena de células hematopoyéticas. En el 33% de los casos, las cepas trasplantadas formaron un hueso compacto de tamaño variable con osteocitos inmersos en las cavidades y una capa osteoblástica desarrollada. En algunos casos, se desarrolló tejido reticular sin hueso ni elementos hematopoyéticos en las esponjas con clones trasplantados. En ocasiones, se formó estroma reticular con una red bien desarrollada de sinusoides, pero no poblado de células hematopoyéticas. Por lo tanto, los resultados obtenidos fueron similares a los datos obtenidos durante el trasplante de clones en gel de colágeno. Sin embargo, si el trasplante de clones cultivados en un sustrato resultó en la formación de tejido de médula ósea en el 5% de los casos, tejido óseo en el 15% y tejido reticular en el 80% de los casos, entonces con el trasplante de cepas monoclonales, se observó la formación de elementos de médula ósea en el 14% de los casos, tejido óseo en el 53% y tejido reticular en el 53% de los casos. Según los autores, esto indica que las condiciones para la implementación del potencial proliferativo y diferenciador de los fibroblastos estromales durante el trasplante en andamios porosos fueron más óptimas que durante su trasplante en vainas óseas y en un sustrato de colágeno.Es posible que el uso de métodos más avanzados de cultivo y trasplante inverso de clones mejore las condiciones para que los clones desarrollen su potencial de diferenciación y modifiquen estas proporciones. De una forma u otra, la principal importancia de los estudios realizados radica en que algunos clones de células estromales son capaces de formar tejido óseo y, simultáneamente, proporcionar un microambiente hematopoyético estromal para tres brotes de hematopoyesis de médula ósea simultáneamente: eritroide, mieloide y megacariocítica, creando así plataformas bastante grandes de tejido hematopoyético y algo de masa ósea.

Los autores abordaron la capacidad de las células progenitoras estromales clonogénicas individuales para experimentar estos tipos de diferenciación celular en un sistema cerrado de cámaras de difusión. Además, era necesario determinar si los clones individuales poseen polipotencia o si la manifestación del potencial de diferenciación requiere la interacción cooperativa de varios clones con un rasgo de citodiferenciación fijo, cuyas diferentes proporciones determinan la formación preferencial de tejido óseo, reticular o cartilaginoso. Mediante la combinación de dos enfoques metodológicos (obtener cepas monoclonales de células progenitoras estromales de médula ósea y trasplantarlas a cámaras de difusión), R. Chailakhyan y coautores (2001) obtuvieron resultados que les permitieron comprender mejor la organización estructural del estroma de la médula ósea. El trasplante de cepas monoclonales de células progenitoras estromales a cámaras de tipo O resultó en la formación de tejido óseo y cartilaginoso, lo que indica la capacidad de los descendientes de una sola célula formadora de colonias estromales para formar simultáneamente tejido óseo y cartilaginoso. La suposición de que el tejido óseo y cartilaginoso se origina a partir de una célula progenitora estromal común se ha planteado repetidamente. Sin embargo, esta hipótesis no tuvo una confirmación experimental correcta. La formación de hueso y cartílago en cámaras de difusión fue la prueba necesaria de la existencia de una célula progenitora común para estos dos tipos de tejido entre las células madre estromales de la médula ósea.

Luego, 29 cepas clonales de los pases segundo-tercero obtenidos de cultivos primarios de médula ósea de conejo se colocaron en cámaras de difusión y se implantaron intraperitonealmente en animales homólogos. Los estudios mostraron que el 45% de las cepas monoclonales de médula ósea poseen potencial osteogénico. Nueve cámaras contenían exclusivamente tejido reticular, pero estaba presente junto con tejido óseo y cartilaginoso en 13 cámaras más, que constituyeron el 76% de todas las cepas. En las cámaras de tipo O, donde fue posible la diferenciación tanto del tejido óseo como del cartilaginoso, se estudiaron 16 cepas. En cuatro cámaras (25%) se formó tanto tejido óseo como cartilaginoso. Cabe señalar una vez más que en los estudios de R. Chailakhyan et al. (2001), las células progenitoras individuales experimentaron de 31 a 34 duplicaciones dentro de una cepa celular, y su progenie comprendió 0,9-2,0 x 109 ^células. El número de mitosis que experimentaron las células progenitoras de cepas policlonales fue prácticamente idéntico al de las cepas monoclonales. La tasa de desarrollo de las cepas policlonales, especialmente en la primera fase de su formación, dependió en gran medida del número de colonias utilizadas para iniciar las cepas. Las cepas diploides de fibroblastos embrionarios humanos (WI-38), cuando se reclonaron en los niveles de duplicación 12-15, también formaron colonias que diferían en diámetro y contenido celular. Las colonias grandes que contenían más de 103 células constituyeron solo el 5-10%. Con un aumento en el número de divisiones, el porcentaje de colonias grandes disminuyó. Las cepas monoclonales y policlonales de fibroblastos estromales de médula ósea conservaron un conjunto diploide de cromosomas después de 20 o más duplicaciones, y la tendencia de su desarrollo fue comparable con la dinámica de desarrollo de las cepas diploides de fibroblastos embrionarios. El análisis del potencial de diferenciación de células progenitoras estromales de médula ósea individuales, realizado mediante el trasplante de cepas monoclonales en cámaras de difusión, mostró que la mitad de ellas eran osteogénicas. Las colonias grandes representaban el 10% de su número total. En consecuencia, el número de células osteogénicas formadoras de colonias correspondía aproximadamente al 5% de su población total. La masa total de células progenitoras osteogénicas identificadas por los autores incluía células capaces de formar simultáneamente tejido óseo y cartilaginoso. Además, se estableció por primera vez que estos dos tipos de tejido en un organismo adulto comparten una célula progenitora común: el 25% de los clones analizados fueron creados por dichas células, y su número dentro de la población total de células progenitoras fue de al menos el 2,5%.

Así, el trasplante heterotópico de clones individuales de fibroblastos de médula ósea ha revelado nuevos aspectos de la organización estructural de la población de células progenitoras mesenquimales. Se han descubierto células progenitoras estromales capaces de transferir un microambiente específico para todos los brotes hematopoyéticos a la vez, cuyo número, entre los clones grandes estudiados en diferentes modelos, oscila entre el 5 y el 15 % (0,5-1,5 % del total de células progenitoras detectadas). Junto con los clones que transfieren el microambiente completo de la médula ósea, existen células progenitoras destinadas únicamente a la osteogénesis, que, al transferirse en un sistema abierto, forman tejido óseo que no favorece el desarrollo de la hematopoyesis. Su número, con respecto al total de células progenitoras, es del 1,5-3 %. Algunas de estas células son capaces de formar tejido óseo con un periodo limitado de automantenimiento. En consecuencia, la población de células progenitoras estromales presenta un potencial de diferenciación heterogéneo. Entre ellas, existe una categoría de células que se consideran células madre estromales, capaces de diferenciarse en las tres direcciones características del tejido estromal de la médula ósea, formando hueso, cartílago y tejido reticular. Los datos presentados permiten esperar que, mediante diversos marcadores celulares, sea posible determinar la contribución de cada tipo de célula estromal a la organización de un microambiente específico y al apoyo de la hematopoyesis en cultivos de Dexter.

Características de las células madre mesenquimales

En los últimos años, se ha establecido que en cultivos estacionarios de médula ósea, las células progenitoras mesenquimales multipotentes están representadas por una población limitada de células agranulares pequeñas (células RS-1) caracterizadas por una baja capacidad de formación de colonias y la ausencia de expresión del antígeno Ki-67 específico para células proliferantes. Los parámetros antigénicos de las células RS-1 latentes difieren del espectro de antígenos de las células progenitoras estromales comprometidas de rápida proliferación. Se ha establecido que una alta tasa de proliferación de células progenitoras comprometidas se observa solo en presencia de células RS-1. A su vez, las células RS-1 aumentan su tasa de crecimiento bajo la influencia de factores secretados por los derivados más maduros de las células progenitoras mesenquimales multipotentes. Parece que las células RS-1 son una subclase de MSC no comprometidas capaces de reciclarse. In vitro, las células progenitoras del estroma de la médula ósea resistentes al 5-fluorouracilo se caracterizan por un bajo contenido de ARN y una alta expresión del gen de la ornitina descarboxilasa, un marcador de células no proliferantes.

La proliferación intensiva de células progenitoras estromales comienza tras su fijación al sustrato. En este caso, se expresa el perfil de marcadores de células poco diferenciadas: SH2 (receptor de TGF-(3)), SH3 (dominio de proteína de señalización), colágeno tipo I y III, fibronectina, receptores de adhesión VCAM-1 (CD106) e ICAM (CD54), cadherina-11, CD44, CD71 (receptor de transferrina), CD90, CD120a y CD124, pero sin la expresión de marcadores característicos de células madre hematopoyéticas (CD34, CD14, CD45). El crecimiento clonal permite el paso repetido de células madre mesenquimales, con la formación de numerosas células pluripotentes progenitoras estromales genéticamente homogéneas en cultivo. Tras 2-3 pases, su número alcanza entre 50 y 300 millones. En un cultivo de densidad suficiente, tras detenerse la proliferación, las células progenitoras del estroma, a diferencia de los fibroblastos del tejido hematopoyético, se diferencian en adipocitos, miocitos, cartílago y células óseas. Una combinación de tres señales reguladoras de diferenciación, que incluyen 1-metil-isobutilxantina (un inductor de la formación intracelular de AMPc), dexametasona (un inhibidor de las fosfolipasas A y C) e indometacina (un inhibidor de la ciclooxigenasa, que también reduce la actividad de la tromboxano sintasa), convierte hasta el 95% de las células mesenquimales progenitoras en adipocitos. La formación de adipocitos a partir de elementos estromales inmaduros se confirma mediante la expresión del gen de la lipoproteína lipasa, la detección histoquímica de apolipoproteínas y los receptores peroxisomales. Las células del mismo clon, bajo la influencia de TGF-β en un medio sin suero, crean una población homogénea de condrocitos. El cultivo celular multicapa de este tejido cartilaginoso se caracteriza por una matriz intercelular desarrollada, compuesta por proteoglicano y colágeno tipo II. En un medio nutritivo con un 10% de ácido láctico, el efecto de un complejo señal de diferenciación, compuesto por β-glicerofosfato (un donante de fosfato inorgánico), ácido ascórbico y dexametasona, en el mismo cultivo de células progenitoras estromales, conduce a la formación de agregados celulares. En estas células, se observa un aumento progresivo de la actividad de la fosfatasa alcalina y de los niveles de osteopontina, lo que indica la formación de tejido óseo, cuya mineralización celular se confirma por un aumento progresivo del contenido de calcio intracelular.

Según algunos datos, la capacidad de las células madre mesenquimales para la división y reproducción ilimitadas de varios tipos de células de la línea de diferenciación mesenquimal se combina con un alto grado de plasticidad. Cuando se introducen en los ventrículos o la sustancia blanca del cerebro, las células madre mesenquimales migran al parénquima del tejido nervioso y se diferencian en derivados de la línea celular glial o neuronal. Además, existe información sobre la transdiferenciación de las MSC en células madre hematopoyéticas tanto in vitro como in vivo. Un análisis más profundo en algunos estudios ha determinado una plasticidad excepcionalmente alta de las MSC, que se manifiesta en su capacidad para diferenciarse en astrocitos, oligodendrocitos, neuronas, cardiomiocitos, células musculares lisas y células musculares esqueléticas. Varios estudios sobre el potencial de transdiferenciación de las MSC in vitro e in vivo han establecido que las células progenitoras mesenquimales multipotentes de origen de la médula ósea se diferencian terminalmente en líneas celulares que forman hueso, cartílago, músculo, nervio y tejido adiposo, así como tendones y estroma que sustentan la hematopoyesis.

Sin embargo, otros estudios no revelaron signos de restricción de la pluripotencia del genoma de células madre mesenquimales ni de las poblaciones progenitoras de células estromales, aunque se estudiaron más de 200 clones de MSC aislados de un cultivo primario para evaluar la posible pluripotencia de las células estromales. La abrumadora mayoría de los clones in vitro conservaron la capacidad de diferenciarse en direcciones osteogénicas, condrogénicas y adipogénicas. Al excluir la probabilidad de migración de células receptoras mediante el trasplante de células madre mesenquimales debajo de la cápsula renal o en cámaras de difusión, resultó que las células progenitoras estromales in situ conservan un fenotipo heterogéneo, lo que indica la ausencia de factores de restricción en la zona de trasplante o la ausencia de pluripotencia de MSC como tal. Al mismo tiempo, se permite la existencia de un tipo raro de células madre pluripotentes somáticas, que son precursoras comunes de todas las células madre adultas.

La multipotencia, pero no la pluripotencia, de las células madre mesenquimales verdaderas, que constituyen una proporción muy pequeña de las células de la médula ósea y son capaces de proliferar bajo ciertas condiciones durante el cultivo in vitro sin diferenciarse, se evidencia por su compromiso inducido con células de hueso, cartílago, tejido adiposo y muscular, así como con tenocitos y elementos estromales que apoyan la hematopoyesis. Como norma, la exposición prolongada a un medio de cultivo con suero fetal bovino provoca la liberación de MSC en células progenitoras estromales comprometidas, cuya progenie experimenta una diferenciación terminal espontánea. In vitro, es posible lograr la formación dirigida de osteoblastos mediante la adición de dexametasona, ß-glicerofosfato y ácido ascórbico al medio de acondicionamiento, mientras que una combinación de señales de diferenciación de dexametasona e insulina induce la formación de adipocitos.

Se ha establecido que antes de entrar en la etapa de diferenciación terminal, las MSC de médula ósea se diferencian inicialmente en células madre mesenquimales similares a fibroblastos bajo ciertas condiciones de cultivo. Los derivados de estas células in vivo participan en la formación de huesos, cartílagos, tendones, tejido adiposo y muscular, así como del estroma que sustenta la hematopoyesis. Muchos autores entienden que el término "células progenitoras mesenquimales multipotentes" significa tanto las propias MSC como las células progenitoras estromales comprometidas de la médula ósea y los tejidos mesenquimales. El análisis clonal de células progenitoras mesenquimales multipotentes de origen de la médula ósea mostró que un poco más de un tercio de todos los clones se diferencian en osteo-, condro- y adipocitos, mientras que las células de los clones restantes solo tienen potencial osteogénico y forman solo condr- y osteocitos. Un clon de células progenitoras mesenquimales multipotentes, como BMC-9, en condiciones microambientales adecuadas, se diferencia en células con fenotipo y características funcionales no solo de osteoblastos, condrocitos y adipocitos, sino también de células estromales que sustentan la hematopoyesis. Un clon de células RCJ3.1 aislado de médula ósea fetal de rata se diferencia en células mesenquimales de diversos fenotipos. Bajo la acción combinada de ácido ascórbico, β-glicerofosfato y dexametasona, los elementos celulares de este clon forman primero miocitos multinucleares y, posteriormente, adipocitos, condrocitos e islotes de tejido óseo mineralizado. La población de células granulares del periostio de fetos de rata corresponde a células progenitoras mesenquimales multipotentes no comprometidas, ya que se caracteriza por una baja tasa de proliferación, no expresa marcadores de diferenciación y en condiciones de cultivo se diferencia para formar condro-, osteo- y adipocitos, así como células musculares lisas.

Por tanto, debe reconocerse que la cuestión de la pluri o multipotencia del genoma de las células madre mesenquimales permanece abierta, lo que, en consecuencia, también afecta a las ideas sobre el potencial de diferenciación de las células progenitoras del estroma, que tampoco ha sido establecido definitivamente.

Una característica importante y comprobada experimentalmente de las células madre mesenquimales es su capacidad para abandonar el nicho tisular y circular en el torrente sanguíneo general. Para activar el programa de diferenciación genética, estas células madre circulantes deben entrar en el microambiente adecuado. Se ha demostrado que, con la introducción sistemática de MSC en el torrente sanguíneo de animales receptores, las células inmaduras se implantan en diversos órganos y tejidos, diferenciándose posteriormente en células sanguíneas, miocitos, adipocitos, condrocitos y fibroblastos. En consecuencia, en zonas tisulares locales, se producen interacciones de regulación de señales entre las células progenitoras estromales comprometidas y no comprometidas, así como entre estas y las células maduras circundantes. Se asume que la diferenciación es inducida por factores reguladores paracrinos de origen mesenquimal y no mesenquimal (factores de crecimiento, eicosanoides, moléculas de la matriz extracelular), que proporcionan conexiones espaciales y temporales en el microambiente de las células progenitoras mesenquimales multipotentes. Por lo tanto, el daño local al tejido mesenquimal debería conducir a la formación de zonas del microambiente de células progenitoras mesenquimales multipotentes que difieren cualitativamente del complejo de señales reguladoras de los tejidos intactos, donde se producen procesos de regeneración fisiológicos en lugar de reparativos. Esta diferencia es fundamental para la especialización del fenotipo celular en el microambiente normal y en el inducido por daño.

Según estos conceptos, es aquí donde se enmarcan los mecanismos que diferencian fundamentalmente los dos procesos conocidos: la regeneración fisiológica y la proliferación inflamatoria. El primero culmina con la restauración de la composición celular especializada del tejido y su función, mientras que el resultado del proceso de proliferación es la formación de elementos maduros del tejido conectivo y la pérdida de la función de la zona dañada. Por lo tanto, para desarrollar programas óptimos para el uso de células progenitoras mesenquimales multipotentes en medicina regenerativa-plástica, es necesario un estudio exhaustivo de las características del impacto de los factores microambientales en la diferenciación de las MSC.

La dependencia de la estructura del compartimento de células madre de los reguladores celulares para y autocrinos, cuya expresión es modulada por señales externas, es indudable. Entre las funciones de los factores reguladores, las más importantes son el control de la división asimétrica de las MSC y la expresión de genes que determinan las etapas de compromiso y el número de divisiones celulares. Las señales externas, de las que depende el desarrollo posterior de las MSC, son proporcionadas por su microambiente. En un estado inmaduro, las MSC proliferan durante un largo tiempo, mientras mantienen la capacidad de diferenciarse en líneas de adipocitos, miofibroblastos, estroma tisular hematógeno, cartílago y células óseas. Se ha establecido que una población limitada de elementos celulares estromales CD34-negativos que circulan en la sangre regresa del torrente sanguíneo general al estroma de la médula ósea, donde se transforma en líneas de células madre hematopoyéticas CD34-positivas. Estas observaciones sugieren que la recirculación de células mesenquimales progenitoras en el torrente sanguíneo mantiene el equilibrio tisular de las células madre estromales en diferentes órganos mediante la movilización de un conjunto común de elementos estromales inmaduros de la médula ósea. La diferenciación de las MSC en células con múltiples fenotipos mesenquimales y su participación en la regeneración o reparación de hueso, cartílago, tejido adiposo y tendones in vivo se ha demostrado mediante modelos de transferencia adoptiva en animales de experimentación. Según otros autores, la migración a distancia de las MSC a lo largo del lecho vascular se combina con el movimiento local o de corta distancia de células progenitoras mesenquimales multipotentes dentro del tejido durante la reparación del cartílago, la regeneración muscular y otros procesos restauradores.

Las reservas locales de células madre de la base del tejido estromal actúan como fuente de células en los procesos de regeneración tisular fisiológica y se reabastecen mediante el transporte a distancia de células madre mesenquimales (CMM) a medida que se consumen los recursos del tejido estromal. Sin embargo, cuando se requiere una movilización urgente del potencial celular reparador, por ejemplo, en caso de politraumatismo, todo el escalón de CMM participa en los procesos de regeneración reparadora, y las células progenitoras mesenquimales de la médula ósea se reclutan a la periferia a través del flujo sanguíneo general.

Trasplante de células madre mesenquimales

Se pueden establecer ciertos paralelismos entre los procesos de regeneración tisular fisiológica y su formación durante el desarrollo intrauterino. En la embriogénesis humana y de mamíferos, la formación de diversos tipos de células especializadas se produce a partir del conjunto ectodérmico, mesodérmico y endodérmico de las capas germinales, pero con la participación obligatoria del mesénquima. La red celular laxa del tejido mesenquimal embrionario desempeña numerosas funciones reguladoras, metabólicas, de estructura y morfogenéticas. La formación de órganos provisionales se produce solo tras la condensación del mesénquima debido al crecimiento clonogénico de células progenitoras, que generan las señales morfogenéticas primarias de la organogénesis. Los derivados estromales del mesénquima embrionario crean la estructura celular de los órganos provisionales y forman la base para su futuro aporte energético-plástico gracias al crecimiento de vasos sanguíneos y linfáticos primarios. En otras palabras, los elementos estromales de la unidad microcirculatoria de los órganos fetales surgen antes de la formación de sus unidades estructurales y funcionales. Además, la migración activa de células mesenquimales durante la organogénesis proporciona orientación espacial de los órganos en desarrollo al marcar sus límites de volumen a través de la restricción de los tipos Hox homeóticos. El marco estromal también sirve como base para el ensamblaje de unidades estructurales y funcionales de los órganos parenquimatosos, que a menudo incluyen células morfogenética y funcionalmente completamente diferentes. En consecuencia, durante la embriogénesis, las funciones del mesénquima son primarias y se realizan a través de la generación de señales reguladoras que activan la proliferación y diferenciación regional de las células epiteliales progenitoras. Las células mesenquimales embrionarias producen factores de crecimiento como HGF-β, HGF-β, CSF, para los cuales las células progenitoras parenquimatosas tienen receptores correspondientes. En el tejido maduro diferenciado de un organismo adulto, la red estromal de células también genera señales para mantener la viabilidad y proliferación de células progenitoras de origen no mesenquimal. Sin embargo, el espectro de señales reguladoras del estroma en la ontogénesis postnatal es diferente (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, etc.) y está dirigido a asegurar la regeneración fisiológica o la reparación de las zonas de tejido dañadas. Además, las características espectrales de los factores reguladores del estroma en cada tipo de tejido e incluso dentro de un mismo órgano son diferentes. En particular, la hematopoyesis y la linfopoyesis con la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas e inmunocompetentes ocurren solo en ciertos órganos, dentro de cuyos límites opera el microambiente del estroma, proporcionando las condiciones para la maduración de las células hematopoyéticas y linfoides. La capacidad de las células hematopoyéticas y linfoides para repoblar un órgano dado, proliferar y madurar en sus nichos microestructurales depende de los factores reguladores del microambiente.

Entre los componentes de la matriz extracelular que producen las células progenitoras mesenquimales multipotentes, cabe destacar la fibronectina, la laminina, el colágeno y los proteoglicanos, así como el CD44 (receptor de hialuronano y osteopontina), que desempeñan un papel fundamental en la organización de las interacciones intercelulares y la formación de la matriz extracelular en la médula ósea y el tejido óseo. Se ha demostrado que las células progenitoras mesenquimales multipotentes de la médula ósea crean un microambiente estromal que proporciona señales inductivas y reguladoras no solo a las MSC, sino también a los progenitores hematopoyéticos y otras células madre no mesenquimales de la médula ósea. Se sabe que la participación de las MSC en la hematopoyesis está determinada por su capacidad de diferenciarse en células estromales que sustentan la hematopoyesis, y esta señal instructiva la reciben las MSC directamente de las células madre hematopoyéticas. Es por esto que en cultivo la red de células progenitoras del estroma sirve como base alimentadora para el desarrollo de todos los clones de células hematopoyéticas.

En un organismo maduro, la intensidad de la hemopoyesis y la linfopoyesis se encuentra en un estado de equilibrio dinámico con el “gasto” de células sanguíneas maduras y células del sistema inmunitario en la periferia. Dado que las células estromales de la médula ósea y los órganos linfoides se renuevan extremadamente raramente, no se produce una reestructuración significativa de las estructuras estromales en ellas. El sistema puede verse desequilibrado por un daño mecánico en cualquiera de los órganos de la hemopoyesis o la linfopoyesis, lo que conduce a cambios secuenciales uniformes que afectan no solo y no tanto a los elementos hematopoyéticos o linfoides como a las estructuras estromales del órgano dañado. En el proceso de regeneración reparativa, primero se forma la base estromal, que luego se repuebla con células hematopoyéticas o inmunocompetentes. Este hecho, conocido desde hace tiempo, hace de la regeneración postraumática un modelo conveniente para estudiar el microambiente estromal de los órganos hematopoyéticos. En particular, el vaciado mecánico de la cavidad medular de los huesos tubulares se utiliza para estudiar la regeneración reparadora de la médula ósea (curetaje), que permite la remoción rápida y efectiva del tejido hematopoyético del estado de equilibrio dinámico. Al estudiar los procesos de regeneración reparadora de los componentes hematopoyéticos y estromales de la médula ósea después del vaciado mecánico de la cavidad medular de la tibia de cobayas, se encontró que no existe una correlación directa entre los índices de regeneración de células hematopoyéticas y estromales (el número de células hematopoyéticas, la concentración y el número de células progenitoras estromales). Además, resultó que un aumento en la población de células progenitoras estromales ocurre en un momento más temprano después del curetaje, y los fibroblastos estromales se vuelven fosfatasa-positivos, lo cual es típico del tejido osteogénico. También se ha establecido que el curetaje de 3-5 huesos tubulares conduce al crecimiento de esta población celular en la médula ósea de los huesos no operados e incluso en el bazo, que en los cobayas es un órgano exclusivamente linfopoyético.

El cuadro morfológico de los procesos reparativos en la médula ósea de tibias cureteadas de cobayas generalmente corresponde a los datos descritos en la literatura obtenidos en experimentos con animales de otras especies, y la dinámica de los cambios que ocurren después de la eliminación del tejido hematopoyético es la misma para todas las especies animales y la diferencia concierne únicamente a los parámetros temporales. Morfológicamente, el orden de las fases de restauración de la hematopoyesis en la cavidad medular vaciada consiste en procesos sucesivos de organización del coágulo sanguíneo, formación de tejido óseo fibroso grueso, su reabsorción, desarrollo de sinusoides y formación de estroma reticular, que posteriormente se repobla con elementos hematopoyéticos. En este caso, el número de células hematopoyéticas progenitoras en el proceso de regeneración del tejido de la médula ósea aumenta en paralelo con el aumento del contenido de células madre hematopoyéticas.

Yu. Gerasimov y coautores (2001) compararon los cambios en el número de células hematopoyéticas y el número de células progenitoras estromales en fases individuales del proceso de regeneración. Resultó que los cambios cuantitativos en las células de la médula ósea en el hueso cureteado corresponden a la dinámica de las características morfológicas de la regeneración. Los autores asocian la disminución en el contenido celular en el regenerado durante los primeros tres días con la muerte de células hematopoyéticas debido al efecto desfavorable del microambiente creado por el tejido reticular proliferante en la médula ósea preservada en la región de la epífisis, así como con la formación de focos de tejido osteoide en este último y daño vascular durante el curetaje. En el séptimo al duodécimo día, un aumento en el nivel de células nucleadas coincide con la aparición de focos individuales de hematopoyesis mieloide en las zonas de proliferación de elementos estromales. El día 20, aparecen áreas significativas de médula ósea regenerada y senos paranasales bien desarrollados, lo que se acompaña de un aumento significativo del número total de células. Sin embargo, el número de elementos hematopoyéticos durante este período es del 68 % del nivel de control. Esto concuerda con datos publicados previamente que indican que el número de células hematopoyéticas tras el legrado alcanza la normalidad solo entre el día 35 y el 40 después de la cirugía.

En el período postraumático temprano, la principal fuente para la restauración de la hematopoyesis son los elementos celulares locales preservados durante el curetaje. En etapas posteriores, la principal fuente de regeneración del tejido hematopoyético de la médula ósea son las células madre que repoblaron las zonas estromales libres. En cuanto a las categorías individuales de células estromales (endoteliales, reticulares y osteogénicas), las fuentes que aseguran su formación durante la reorganización de la cavidad de la médula ósea siguen sin estar claras. Los resultados del estudio de Yu. V. Gerasimov y coautores (2001) indican que en la médula ósea preservada después del curetaje, la concentración de células que forman colonias de fibroblastos es significativamente mayor que en la médula ósea normal. Los autores creen que el curetaje resulta en un lavado selectivo más intensivo de las células hematopoyéticas en comparación con las células estromales formadoras de colonias, que participan en la formación del estroma y están más fuertemente asociadas con su sustancia principal que las células hematopoyéticas.

La dinámica del cambio en el número de células que forman colonias de fibroblastos se correlaciona con la intensidad de los procesos de osteogénesis, la posterior reabsorción de las trabéculas óseas y la formación del estroma reticular, que está poblado por células hematopoyéticas. La mayoría de las células progenitoras del estroma en los términos especificados de regeneración forman tejido óseo fibroso grueso y estroma reticular. En caso de fracturas femorales en condiciones de osteosíntesis prolongada, en el quinto día en la zona de regeneración la concentración y el número de células que forman colonias de fibroblastos aumenta, y durante el período de formación ósea intensiva su número se multiplica por seis. Se sabe que las células de la médula ósea que forman colonias de fibroblastos tienen propiedades osteogénicas. El número de células progenitoras del estroma aumenta antes del asentamiento del territorio de la médula ósea cureteada por células hematopoyéticas. Esto concuerda bien con los datos de que las células del estroma proporcionan la formación de un microambiente hematopoyético. Aparentemente, la creación de un microambiente hematopoyético corresponde a un cierto nivel de regeneración del tejido estromal, y el número de células hematopoyéticas aumenta con la expansión de la plataforma estromal adecuada para la hematopoyesis.

De gran interés son los datos de los autores, que indican que, inmediatamente después del legrado, aumenta el número de células progenitoras estromales en las zonas remotas del esqueleto. A partir de la sexta hora y hasta el vigésimo día inclusive, se observa un aumento de más del doble tanto en la concentración como en el número de células que forman colonias de fibroblastos en la tibia contralateral. El mecanismo de este fenómeno probablemente se asocie a que una lesión masiva de la médula ósea provoca la formación de un gran número de coágulos sanguíneos, con la destrucción simultánea de un número significativo de plaquetas y la liberación del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en la sangre, lo que se sabe que causa la proliferación de células que forman colonias de fibroblastos ubicadas en el cuerpo fuera del depósito proliferativo. En experimentos con conejos, la administración local de MSC promueve la restauración del tejido cartilaginoso de la articulación de la rodilla dañada quirúrgicamente, lo que puede asociarse con la formación de condrocitos a partir de las MSC inyectadas. Sin embargo, la regeneración reparadora de defectos óseos en ratas de laboratorio se mejora significativamente mediante el uso de células madre mesenquimales encapsuladas en una estructura cerámica. Por lo tanto, se puede asumir que, si no es el RBOC, algún otro factor originado en células estromales dañadas ejerce un efecto estimulante a distancia sobre la proliferación de células progenitoras mesenquimales en zonas intactas de médula ósea y estimula su migración a la zona del defecto medular. A su vez, esto se contradice con datos publicados en años anteriores que indican que las células estromales responsables del microambiente, a diferencia de las células hematopoyéticas, no son capaces de migrar y provienen de fuentes locales.

Sin embargo, los resultados del estudio de Yu. Gerasimov y coautores (2001) indican que el trauma mecánico causa no solo una reestructuración aguda del tejido estromal en el hueso cureteado, sino también cambios significativos en el estroma en huesos intactos distantes, es decir, hay una respuesta sistémica del tejido estromal al trauma local. Además, cuando se inflige politraumatismo (curetaje múltiple), esta reacción se potencia y se observa no solo en el hueso operado y partes distantes del esqueleto, sino también en los órganos linfoides, en particular en el bazo. El mecanismo de tal respuesta sistémica del tejido estromal de la médula ósea y el bazo al traumatismo local y al politraumatismo sigue siendo desconocido. Se supone que este proceso está asociado con la acción de un factor humoral secretado por el estroma mesenquimal de la cavidad medular de la médula ósea. La posibilidad de que las células del estroma de la médula ósea y del bazo produzcan un factor humoral no específico del órgano, responsable de la proliferación de células que forman colonias de fibroblastos, está evidenciada por los datos sobre su actividad estimulante de colonias en cultivos en monocapa de médula ósea.

En este sentido, cabe destacar que, con la administración sistémica de células progenitoras mesenquimales multipotentes, sus derivados repoblaron no solo la médula ósea, sino también otros tejidos, lo que se utiliza, en particular, en terapia génica. Se ha demostrado que, con la administración intravenosa de grandes cantidades de MSC con genoma de tipo silvestre a ratones con una mutación en el gen del colágeno I, las células del donante sustituyen hasta el 30 % de las células del tejido óseo y cartilaginoso de los receptores. Además, las células madre mesenquimales de ratón transfectadas que secretan IL-3 humana favorecen eficazmente la hematopoyesis durante 9 meses tras su administración simultánea con células madre hematopoyéticas humanas a ratones inmunodeficientes.

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Modificación genética de células madre mesenquimales

Entre los éxitos de la modificación genética experimental de MSC, cabe destacar la transfección del gen del factor IX en MSC humanas, seguida de la transferencia de células transfectantes a ratones inmunodeficientes. Esto induce la aparición de factor B antihemofílico en sangre durante ocho semanas tras el trasplante. En este experimento, se llevó a cabo la modificación postraduccional del factor IX mediante la y-glutamil carboxilasa en las células transfectadas. La transducción de MSC con un vector retroviral que codifica el factor IX humano fue menos exitosa: la administración posterior de estas células a un perro con hemofilia B proporcionó un nivel terapéutico de factor IX, manteniendo una hemostasia de coagulación normal, durante solo doce días.

El trasplante de células madre mesenquimales al parénquima cerebral de animales ha demostrado que las células inmaduras del donante se transforman en poblaciones neuronales y gliales. El injerto de derivados neuronales de tejido mesenquimal sano del donante permite, en teoría, corregir anomalías genéticas del metabolismo cerebral en pacientes con enfermedad de Gaucher y otros trastornos del metabolismo lipídico, gangliósido o de carbohidratos.

La búsqueda experimental de condiciones para la transdiferenciación de células madre estromales de médula ósea en células progenitoras neuronales y de tejido hepático continúa. La atención de los investigadores se centra en la combinación de inductores de diferenciación y medios acondicionados especiales. En particular, para aislar el cultivo primario de células estromales, se siembran células de médula ósea lavadas y resuspendidas en medio de cultivo DMEM/F12 (1/1) con 10 % de suero fetal bovino a una densidad de 200 000/cm². Transcurridas 24 horas, se eliminan las células no adherentes y se cultivan células fibroblásticas adheridas al plástico durante una semana. Para la diferenciación de células estromales de médula ósea en neuroblastos, se utiliza un medio acondicionado obtenido mediante cultivo primario de fibroblastos embrionarios de ratón durante tres días, así como medio DMEM/F12 (1/1) con suero bovino fetal al 2% y la adición de 20 ng/ml de NF o ácido retinoico 10-6 M (neuroinductores que se utilizan para la diferenciación neuronal de células madre embrionarias de ratón y humano). La diferenciación de células estromales de médula ósea en células precursoras de hepatocitos se induce en un medio acondicionado creado como resultado del cultivo primario de células hepáticas embrionarias de ratón durante tres días en medio DMEM/F12 (1/1) con la adición de suero bovino fetal al 10%.

Aquí debe notarse una vez más que las células formadoras de colonias del estroma de la médula ósea son heteromórficas y pueden dividirse en dos tipos. El primer tipo incluye células similares a fibroblastos que forman filopodios con núcleos grandes y uno o dos nucléolos. El segundo tipo está representado por pequeñas células fusiformes. Cuando se cultivan células de ambos tipos en un medio acondicionado obtenido en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios primarios de ratón, aparecen células similares a neuroblastos en el cultivo en el tercer o cuarto día. En esta etapa, lo más frecuente es que tengan una forma fusiforme con uno o dos procesos largos que terminan en filopodios. Menos comunes son las células piramidales o estrelladas con dendritas cortas. Las dendritas de algunos neuroblastos tienen expansiones características (brotes de crecimiento) y ramas en su parte distal, mientras que otros tienen conos de crecimiento distintivos con filopodios, a través de los cuales crecen las dendritas. Características morfológicas similares (brotes y conos de crecimiento con filopodios) inherentes a los neuroblastos que se diferencian en neuronas se han descrito detalladamente en estudios sobre neurogénesis. Con base en esto, algunos autores concluyen que las células que encontraron en el cultivo son neuroblastos. En particular, E. Shchegelskaya y coautores (2002), después de cultivar un cultivo primario de células estromales durante dos semanas en un medio acondicionado que cambiaba cada 3 o 4 días, encontraron que algunas de las células proliferaban mientras mantenían un estado indiferenciado. Exteriormente, dichas células se parecían a fibroblastos y se detectaron en el cultivo junto con neuroblastos en diferenciación. La mayoría de las células (alrededor del 80%) se encontraban en diferentes etapas de diferenciación en células del tejido nervioso, principalmente en neuronas. Los procesos dendríticos de estas células estaban en estrecho contacto entre sí, de modo que las células formaron gradualmente secciones de la red nerviosa sobre el sustrato en forma de largas hebras multicelulares. Los procesos dendríticos de los neuroblastos se alargaron significativamente, algunos de ellos superaron la longitud del propio cuerpo neuronal entre 8 y 10 veces. La proporción de células piramidales y estrelladas aumentó gradualmente. Las dendritas de las células estrelladas se ramificaron. Según los autores, la diferenciación posterior de las células piramidales y estrelladas en comparación con las células fusiformes corresponde a la secuencia de etapas de la neurogénesis normal en animales. Como resultado, los autores concluyen que las células madre estromales de la médula ósea experimentan neurogénesis inducida, durante la cual los tres tipos principales de neuronas se forman a partir de neuroblastos in vitro. También se detectaron precursores de células nerviosas durante el cultivo de células estromales de la médula ósea durante 3-4 días en un medio con 2% de suero fetal y 20 ng/ml de LIF. Pero en este caso, las células madre se dividieron muy lentamente, la diferenciación de los neuroblastos se produjo solo en el 30% de los casos y no formaron redes neuronales. Utilizando el ácido retinoico como uno de los inductores de la diferenciación de las células nerviosas, los autores obtuvieron hasta un 25-30% de células nerviosas en el cultivo,Con predominio de elementos gliales: astrocitos y oligodendrocitos. Las neuronas constituyeron solo un tercio de todas las células nerviosas, aunque estaban representadas por los tres tipos: fusiformes, piramidales y estrelladas. Al sexto día de cultivo de células estromales en un medio con ácido retinoico, las células nerviosas se diferenciaron más y se encontraron axones en neuronas piramidales individuales, que en la neuroontogénesis normal aparecen más tarde que la formación de los procesos dendríticos. Según los autores, a pesar del bajo rendimiento de células nerviosas, el método de inducción con ácido retinoico tiene sus ventajas: los oligodendrocitos y astrocitos realizan funciones mielinizantes y nutricionales durante el crecimiento de dendritas y axones, y son necesarios para la formación normal del tejido nervioso. Por lo tanto, para la reparación de las áreas dañadas in vivo, es mejor utilizar una suspensión de neuronas enriquecida con células gliales.

En la segunda serie de experimentos, los autores intentaron inducir la diferenciación de células estromales de médula ósea en células hepáticas. Tras tres días de cultivo de células madre estromales de médula ósea en un medio acondicionado obtenido mediante la incubación de hepatocitos embrionarios de ratón, se encontraron células grandes y esféricas, a menudo binucleares, con inclusiones citoplasmáticas de diversos tamaños. Estas células se encontraban en diferentes etapas de diferenciación y diferían en tamaño, número de núcleos e inclusiones en el citoplasma. Se detectó glucógeno en la mayoría de estas células, por lo que los autores las identificaron como células precursoras de hepatocitos. Dado que no se encontraron células similares a neuroblastos en el cultivo, se concluyó que el medio acondicionado obtenido como resultado del cultivo de hepatocitos embrionarios carecía de factores de diferenciación de células nerviosas y, por el contrario, contenía factores que inducían la diferenciación de células estromales de médula ósea en células precursoras de hepatocitos. En conclusión, los autores sugieren la presencia de pluripotencia en las células del estroma de la médula ósea, ya que se diferencian in vitro en células de tejido nervioso o hepático dependiendo de los medios acondicionados específicos y de los inductores utilizados.

Algunos estudios han demostrado correctamente la diferenciación de las células estromales de la médula ósea en cardiomiocitos, cartílago, tejido óseo y nervioso. Existe evidencia de que entre las células de la médula ósea existen poblaciones de células madre capaces de diferenciarse en hepatocitos. A la luz de estos datos, los resultados de los experimentos mencionados en ratones pueden considerarse una confirmación adicional de la presencia en la médula ósea de células madre mesenquimales pluripotentes capaces de diferenciarse en células de diversos tejidos de un organismo adulto.

Trasplante de células madre mesenquimales

En transplantología clínica, las células madre mesenquimales humanas pueden utilizarse para asegurar la proliferación de células madre hematopoyéticas, así como de sus descendientes precomprometidos. En particular, la administración de células madre hematopoyéticas autólogas y MSC a pacientes con cáncer tras quimioterapia de dosis alta acelera la recuperación del recuento de neutrófilos y plaquetas en sangre periférica. Los trasplantes alo y autólogos de células madre mesenquimales se utilizan para tratar el mieloma múltiple, la anemia aplásica y la trombocitopenia espontánea, enfermedades asociadas con un defecto primario en el estroma del tejido hematopoyético. La eficacia de la terapia celular en patología oncohematológica es en muchos casos mayor con la administración simultánea de células madre estromales y hematopoyéticas, lo que se manifiesta en una reducción del periodo postoperatorio de recuperación de la hematopoyesis y una disminución de la mortalidad por destrucción no selectiva de células cancerosas regionales y circulantes, en la que también mueren las células hematopoyéticas progenitoras del paciente. Las perspectivas del uso de células madre mesenquimales multipotentes y otras células progenitoras mesenquimales multipotentes en la práctica clínica se deben a la relativa facilidad de obtenerlas a partir de aspirados de médula ósea, su expansión en cultivo y la transfección de genes terapéuticos. Asimismo, la implantación local de células progenitoras mesenquimales multipotentes puede utilizarse para compensar defectos tisulares locales y, en caso de disfunciones sistémicas de tejidos de origen mesenquimal, no se descarta su introducción en el torrente sanguíneo general.

Los autores de trabajos que analizan las perspectivas del uso de las MSC para el trasplante local y sistémico, así como para la terapia génica desde la perspectiva de la biología celular del estroma, son más cautelosos en su razonamiento. Tradicionalmente, la médula ósea postnatal se considera un órgano compuesto por dos sistemas principales de líneas celulares claramente definidas: el tejido hematopoyético propiamente dicho y el estroma de soporte asociado a él. Por lo tanto, inicialmente, las células madre mesenquimales de la médula ósea se consideraron exclusivamente como una fuente de base estromal para la producción de factores reguladores del microambiente hematopoyético. Posteriormente, los investigadores se centraron en estudiar el papel de las MSC como fuente madre de tejidos esqueléticos. Los datos más recientes indican un potencial inesperado para la diferenciación de las células estromales de la médula ósea con la formación de tejido neural o muscular. En otras palabras, las células madre mesenquimales exhiben plasticidad transgerminal: la capacidad de diferenciarse en tipos celulares fenotípicamente no relacionados con las células del tejido original. Al mismo tiempo, algunos aspectos de la biología de las células estromales de la médula ósea siguen siendo inciertos y sin resolver, tanto en términos biológicos generales como en detalles individuales, incluyendo la identificación, la naturaleza, el origen, el desarrollo y la función in vivo de las células estromales de la médula ósea, así como el potencial de diferenciación permisible ex vivo y las posibilidades de uso terapéutico in vivo. Los datos obtenidos sobre el potencial de las MSC, así como los resultados de estudios sobre el potencial regenerativo de otras células madre, contradicen abiertamente los dogmas establecidos en biología.

Cuando se cultivan a baja densidad, las células madre estromales de la médula ósea forman colonias diferenciadas, cada una derivada de una única célula progenitora. El porcentaje de células progenitoras estromales en las células nucleadas de la médula ósea, determinado por su capacidad de formación de colonias, depende en gran medida tanto de las condiciones de cultivo como de la especie de MSC. Por ejemplo, en roedores, la presencia de células alimentadoras de médula ósea irradiadas y suero en el cultivo es absolutamente necesaria para obtener el máximo número de células progenitoras estromales, mientras que en humanos, la eficiencia de formación de colonias de las células madre mesenquimales es independiente tanto del alimentador como del medio de cultivo. El número de factores mitogénicos conocidos que estimulan la proliferación de células progenitoras estromales es limitado. Estos incluyen PDGF, EGF, FGF, TGF-β e IGF1. En condiciones óptimas de cultivo, las líneas de MSC policlonales pueden soportar más de 50 divisiones celulares in vitro, lo que permite obtener miles de millones de células estromales de médula ósea a partir de 1 ml de su aspirado.

Sin embargo, la población de células estromales de la médula ósea es heterogénea, lo que se manifiesta tanto por la variabilidad en el tamaño de las colonias, las diferentes tasas de formación de las mismas, como por una variedad de morfología celular, que abarca desde células fusiformes similares a fibroblastos hasta células planas de gran tamaño. Durante el desarrollo de dichos cultivos, también se observa heterogeneidad fenotípica después de 20 días. Algunas colonias se caracterizan por una alta expresión de fosfatasa alcalina, otras no la expresan en absoluto, y las colonias del tercer tipo son fosfatasa-positivas en la región central y fosfatasa-negativas en la periferia. Las colonias individuales forman nódulos de tejido óseo (el inicio de la mineralización de la matriz se marca mediante tinción con rojo de alizarina o para calcio según Van Koss). En otras colonias, se produce acumulación de grasa, identificada mediante tinción G con rojo de aceite. Con menor frecuencia, las colonias de células madre mesenquimales forman cartílagos teñidos con azul alcián).

Tras el trasplante ectópico en animales de experimentación, las líneas policlonales MGK forman hueso ectópico con un estroma reticular asociado con mielopoyesis y adipocitos, y, con menor frecuencia, con tejido cartilaginoso. Cuando se trasplantan líneas monoclonales de células estromales de médula ósea, en algunos casos se observa quimerismo: el hueso de novo está compuesto por células de tejido óseo, contiene estroma y adipocitos de origen donante, mientras que las células del linaje hematopoyético y del sistema vascular provienen del receptor.

Los resultados de estos estudios confirman la naturaleza madre de la célula progenitora estromal de la médula ósea de la que se derivó la línea clonal. También indican que no todas las células clonogénicas en cultivo son verdaderamente células madre multipotentes. Algunos investigadores creen, y compartimos su opinión, que la información más fiable sobre el potencial real de diferenciación de clones individuales solo puede obtenerse in vivo tras el trasplante, y no determinando el fenotipo de sus derivados in vitro. La expresión en cultivo de marcadores fenotípicos de osteogénesis, condrogénesis o adipogénesis (determinada por ARNm o técnicas histoquímicas), e incluso la producción de matriz mineralizada, no reflejan el grado de pluripotencia de un clon individual in vivo. Por lo tanto, la identificación de células madre en un grupo de células estromales solo es posible a posteriori, en las condiciones adecuadas de un ensayo de trasplante biológico. En particular, la condrogénesis se observa muy raramente en sistemas de trasplante abiertos, mientras que la formación de cartílago es bastante común en sistemas cerrados, como cámaras de difusión o cultivos micromasivos in vitro de células estromales, donde se logra una baja tensión de oxígeno local, lo que promueve la formación de tejido cartilaginoso. Por lo tanto, incluso la técnica de trasplante, así como las condiciones inespecíficas de cultivo in vitro, afectan significativamente el rango de diferenciación de las MSC.

El trasplante experimental en condiciones específicas es el método de referencia para determinar el potencial de diferenciación de las células estromales de la médula ósea y un elemento clave para su identificación. Históricamente, los estudios sobre el trasplante de células estromales de la médula ósea se han asociado con el problema general del trasplante de médula ósea. Se ha establecido que el microambiente hematopoyético se crea mediante el trasplante de líneas celulares estromales de médula ósea y propicia el desarrollo ectópico de tejido hematopoyético en la zona de trasplante. El origen del microambiente, proveniente del donante, y el tejido hematopoyético, del huésped, permite considerar el hueso ectópico como un verdadero trasplante de médula ósea "invertido". El trasplante local de células estromales de médula ósea promueve una corrección eficaz de los defectos óseos, más pronunciada que con la regeneración reparativa espontánea. Diversos estudios preclínicos en modelos experimentales han demostrado de forma convincente la posibilidad de utilizar trasplantes de células estromales de médula ósea en ortopedia, aunque se requiere un trabajo y un análisis exhaustivos para optimizar estos métodos, incluso en los casos más sencillos. En particular, aún no se han establecido las condiciones óptimas para la expansión de células estromales osteogénicas ex vivo, la estructura y composición del portador ideal, así como el número de células necesarias para la regeneración ósea volumétrica, siguen sin desarrollarse.

Además del uso de células estromales de médula ósea expandidas ex vivo para la regeneración de tejidos de origen mesenquimal, la plasticidad poco convencional de las MSC abre la puerta a posibles aplicaciones para la regeneración de células neuronales o la administración de productos génicos al SNC. En principio, esto simplifica la terapia celular para el daño del sistema nervioso, ya que no es necesario obtener células madre neuronales humanas autólogas. Se han descrito posibles aplicaciones de las células de médula ósea para la generación de cardiomiocitos y células progenitoras miogénicas de origen tanto estromal como extraestromal.

Se están realizando experimentos sobre el trasplante sistémico de células estromales de médula ósea para el tratamiento de enfermedades esqueléticas comunes. Sin duda, las células estromales de médula ósea son la población responsable de los trastornos genéticos en las enfermedades esqueléticas, como lo demuestra la transferencia vectorial de información genética mediante estas células, que conduce a la formación de tejido óseo patológico en animales de experimentación. Sin embargo, aún no se ha demostrado la capacidad de las células estromales para implantarse, injertarse, proliferar y diferenciarse en los huesos esqueléticos tras su introducción en el torrente sanguíneo general.

Esto se debe en parte a que en el trasplante estándar de médula ósea el estroma no se trasplanta junto con el tejido hematopoyético, por lo que aún no se han desarrollado criterios estrictos para evaluar el injerto exitoso de células estromales administradas sistémicamente. Debe recordarse que la presencia de genes marcadores en extractos de tejido o el aislamiento de células de origen donante en cultivo no indica el injerto de las células, sino solo su supervivencia. Incluso la inyección intraarterial de células estromales de médula ósea en una extremidad de ratón puede conducir a un injerto prácticamente nulo, a pesar del hecho de que las células de origen donante se encuentran en grandes cantidades dentro de la microvasculatura de la médula ósea. Desafortunadamente, dichas células generalmente se describen como "injertadas" simplemente sobre la base de la detección de genes marcadores para células donantes en cultivo ex vivo. Además, se debe proporcionar evidencia convincente de la integración a largo plazo de células diferenciadas y funcionalmente activas de origen donante en los tejidos en estudio. En muchos artículos publicados sobre el injerto de células estromales de médula ósea en el esqueleto, llama la atención la ausencia de datos claros de este tipo. Sin embargo, cabe destacar que algunos experimentos con animales, aunque correctos, han demostrado un injerto limitado, pero real, de células progenitoras estromales tras su administración sistémica.

Estos datos concuerdan con los resultados de estudios sobre la posibilidad de transportar células progenitoras miogénicas de la médula ósea al músculo a través del sistema vascular. Sin embargo, no debe olvidarse que tanto el tejido esquelético como el muscular se forman durante el desarrollo y el crecimiento a partir de movimientos celulares extravasculares que utilizan procesos de migración que no involucran la circulación sanguínea. Si existe una vía circulatoria independiente para transportar células progenitoras a los tejidos en fase sólida, ¿es posible asumir la existencia de células progenitoras mesenquimales circulantes fisiológicamente? ¿Cuál es el origen de estas células tanto en el organismo en desarrollo como en el posnatal, y cómo penetran la pared vascular? La solución de estas preguntas parece absolutamente necesaria y requiere un análisis preclínico minucioso. Incluso después de encontrar respuestas a estas preguntas, los aspectos cinéticos problemáticos asociados con el crecimiento esquelético y la remodelación del tejido conectivo permanecerán sin resolver. Al mismo tiempo, el tratamiento de los trastornos de la osteogénesis mediante la sustitución de toda la población de células progenitoras esqueléticas mutadas por elementos estromales sanos parece ser una perspectiva clínica real. En este caso, las zonas de fractura local o las deformaciones debidas a la osteogénesis patológica, así como los cambios destructivos en el tejido óseo, pueden corregirse mediante células madre estromales cultivadas in vitro. Por lo tanto, es recomendable centrar la investigación futura en los problemas de transformación o corrección genética de células progenitoras osteogénicas autólogas mutadas ex vivo.

La ingeniería genética celular, ya sea a corto o largo plazo, se ha convertido en la base de la biología celular y molecular, fuente de numerosos descubrimientos científicos sobre el papel de las proteínas individuales en el metabolismo celular in vitro e in vivo. El uso de tecnologías moleculares para la corrección de patologías hereditarias y enfermedades humanas resulta muy prometedor para la medicina práctica, ya que las propiedades de las células madre estromales de la médula ósea permiten desarrollar esquemas de trasplante únicos para la corrección de enfermedades genéticas del esqueleto. Al mismo tiempo, las células precursoras mesenquimales pueden obtenerse fácilmente del futuro receptor, son susceptibles a la manipulación genética y capaces de multiplicarse en grandes cantidades en poco tiempo. El uso de células madre mesenquimales permite evitar las limitaciones y los riesgos asociados a la administración de material genético directamente al paciente mediante vectores intravasculares. Una estrategia similar se aplica a las células madre embrionarias, pero las células estromales de médula ósea postnatales autólogas son un material más preferible, ya que su introducción excluye posibles complicaciones inmunológicas postrasplante. Para lograr un efecto a corto plazo, por ejemplo, para acelerar la regeneración ósea, el método más óptimo es la modificación genética de células madre mesenquimales mediante electroporación, fusión química, lipofección, plásmidos y construcciones adenovirales. En particular, la transfección viral en células estromales de médula ósea BMP-2 ha demostrado ser eficaz para acelerar la regeneración ósea en politraumatismos experimentales. La creación de construcciones de vectores adenovirales es preferible debido a la ausencia de toxicidad. Sin embargo, la modificación genética de células estromales de médula ósea en este caso se caracteriza por una estabilidad extremadamente baja. Además, las células estromales de médula ósea transformadas normales requieren el uso de vectores portadores de información genética que son 10 veces más infecciosos que otros tipos de células, lo que aumenta significativamente el porcentaje de muerte de las células transfectadas.

El tratamiento de enfermedades recesivas causadas por la baja o nula actividad biológica de ciertos genes requiere la modificación a largo plazo o permanente de células madre mesenquimales, lo que requiere el uso de virus adenoasociados, retrovirus, lentivirus o quimeras adenorretrovirales. Las regiones de transporte de estos virus son capaces de transferir grandes transfecciones de ADN (hasta 8 kb). La literatura científica ya ha reportado sobre la actividad biológica exógena de células estromales de médula ósea transfectadas con construcciones retrovirales que codifican la síntesis de moléculas reguladoras y marcadoras: IL-3, CD2, factor VIII, así como enzimas involucradas en la síntesis de L-DOPA. Sin embargo, incluso en estos estudios, los autores señalan una serie de limitaciones que deben superarse antes de la aplicación práctica de esta tecnología. El primer problema es optimizar el proceso de modificación de MSC ex vivo. Se sabe que la proliferación a largo plazo (3-4 semanas) de células estromales de médula ósea in vitro reduce su transfección. Al mismo tiempo, para lograr un alto nivel de modificación genética de las MSC, es necesario realizar varios ciclos de transfección. El segundo problema está relacionado con la duración de la expresión génica terapéutica, que aún no supera los cuatro meses. Una disminución natural de la expresión génica efectiva se debe a la inactivación del promotor y la muerte de las células modificadas. Ante las perspectivas generales de transferencia de información genética mediante células madre mesenquimales, los resultados de estudios preliminares indican la necesidad de optimizar aún más los métodos de transfección ex vivo, la elección de un promotor adecuado que regule la actividad biológica en la dirección deseada y un aumento de la capacidad de las células estromales de la médula ósea modificadas para automantenerse in vivo tras el trasplante. Cabe destacar que el uso de construcciones retrovirales para modificar las células estromales de la médula ósea en la dirección deseada no siempre requiere su injerto obligatorio. Las células madre mesenquimales transfectadas pueden realizar una función correctiva en el contexto de una residencia estable y sin la incorporación física activa obligatoria ni su funcionamiento en el tejido conectivo. En este caso, deben considerarse como una minibomba biológica que produce in vivo un factor cuya deficiencia determina la manifestación de la patología genética.

El uso de células estromales de médula ósea transformadas para el tratamiento de la patología genética dominante, caracterizada por la expresión de un gen con actividad biológica patológica o anormal, es mucho más problemático, ya que en este caso es necesario bloquear la transferencia o implementación de información genética distorsionada. Uno de los métodos de ingeniería genética es la recombinación homóloga de células madre embrionarias para crear animales transgénicos. Sin embargo, es poco probable que el bajo grado de recombinación homóloga, junto con los problemas de identificación, separación y expansión de dichos recombinantes, contribuya a la generalización de este método en un futuro próximo, incluso si se desarrollan nuevos métodos tecnológicos. El segundo enfoque en la terapia génica de la patología dominante se basa en la corrección automática del ADN dañado, ya que las mutaciones genéticas pueden corregirse introduciendo ADN exógeno con la secuencia deseada (oligonucleótidos cortos de ADN u oligonucleótidos quiméricos de ARN/ADN), que se une a los homólogos en el genoma dañado. La tercera opción implica bloquear la transmisión de información patológica, lo que se consigue mediante el uso de oligonucleótidos específicamente diseñados que se unen a un gen específico para formar una estructura helicoidal ternaria que elimina la posibilidad de transcripción.

Aunque la corrección de una enfermedad genética a nivel genómico sigue siendo el método terapéutico más óptimo y preferido, el ARNm también es un vector prometedor (posiblemente incluso más accesible) para bloquear un gen negativo dominante. Las moléculas de proteína con oligonucleótidos antisentido o secuencias completas que bloquean la unión del ARNm al aparato biosintético celular se han utilizado durante mucho tiempo para inhibir la traducción o aumentar la degradación del ARNm. Además, el ARN bicatenario induce una rápida degradación del ARNm, cuyo mecanismo aún no está claro. Sin embargo, es improbable que la mera eliminación de los ARNm transcritos de un alelo mutante con mutaciones cortas o simples promueva la expresión del ARNm del alelo normal. Una alternativa es el uso de ribosíntesis de cabeza de martillo y horquilla, que tienen la capacidad de unirse a regiones altamente específicas del ARNm con la subsiguiente inducción de su escisión e inactivación durante la traducción. Actualmente se está estudiando la posibilidad de utilizar este método en el tratamiento de la osteogénesis patológica. Independientemente de cuál sea exactamente el objetivo (elementos genómicos o citoplasmáticos), el éxito de las nuevas tecnologías de terapia génica estará determinado por la eficiencia de la inclusión de reactivos en las células del estroma de la médula ósea ex vivo, la elección óptima de un vector específico y la capacidad estable de las células madre mesenquimales para expresar los factores necesarios in vivo.

Así pues, el descubrimiento de las células madre mesenquimales, con sus propiedades inesperadas, crea un nuevo esquema conceptual para el desarrollo de líneas celulares. Sin embargo, se necesita más investigación interdisciplinaria para comprender el papel biológico de las células madre estromales, su naturaleza, su capacidad de transdiferenciación o desdiferenciación, su importancia fisiológica durante el desarrollo embrionario, el crecimiento posnatal, la maduración y el envejecimiento, así como en las enfermedades humanas.