Células madre embrionarias

El descubrimiento de las células madre embrionarias surgió no accidentalmente, sino que apareció en el suelo preparado de la investigación científica en el campo de la biología del desarrollo. El término "célula madre" se introdujo en medicina en 1908 en la Sociedad de Hematología Congreso en Berlín, Alexander Maximov aplica a las células hematopoyéticas. Mucho antes de que el aislamiento y la preparación de líneas estables de células madre embrionarias pluripotentes en el desarrollo temprano del proceso de investigación utilizan terato- vástago (células de embriones de carcinoma con el cual estudió los mecanismos desconocidos de la embriogénesis, incluyendo la secuencia de la expresión de genes tempranos y los productos de proteína de su trabajo.

Pero, ¿la totipotencia del genoma humano se pierde irremediablemente en el proceso de la evolución? No, y la embriogénesis es prueba. Si esto es así, ¿cuándo, en principio, se realizará el segundo camino del desarrollo evolutivo? Probablemente, cuando una persona abandona el Cosmos, donde las condiciones ambientales serán relativamente constantes durante bastante tiempo. La pérdida de hueso (desmineralización ósea en un estado de ingravidez) remodelación muy lentamente susceptible y regeneración pueden ser considerados como el primer paso para proceso de adaptación humana como especie de la existencia en el espacio. Sin embargo, el pago por el segundo camino de desarrollo evolutivo será diferente: la esterilidad será el precio por devolver todas las células de totipotencia y plasticidad absoluta. Así que multiplicar en este mundo de "camaleones evolutivos" no tendrá meiosis, otpochkovaniem. Pero viviremos mucho tiempo. La inmortalidad de la telomerasa es la inmortalidad de la ameba. En un organismo multicelular, las células madre son el sustrato de la longevidad cuantitativa y cualitativa.

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Fuentes de células madre embrionarias

Fuentes actuales de las células madre embrionarias para pruebas de laboratorio son Line murino teratocarcinoma (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) y teratocarcinoma humano (NTERA-2, TERA-2 , H-9 clon), así como Hess Trauneona. Sin embargo, la presencia detalla pasaporte celular indicando fenotipo inmune, los resultados de análisis de los cromosomas de los perfiles de expresión de mRNA expuestos receptores y la señalización intracelular de proteínas no compensan inconvenientes significativos teratokartsinomnyh líneas ESC - rápida pérdida de totipotencia y imposibilidad de aplicación en los ensayos clínicos, y la diferenciación mixto en cultivo es muy difícil aislar línea pura especializada de una población heterogénea de células. Por lo tanto, por lo general una fuente CES líneas producidas con fines clínicos, sirve como la masa celular interna del blastocisto, embriones blastómeros individuales de estadio de 8 células de desarrollo, las células de mórula etapas posteriores, y de células germinales primaria.

Cabe señalar que las células de teratocarcinoma, aunque tienen la propiedad de la pluripotencia, se caracterizan por un potencial pluripotente significativamente menor en comparación con ESC. Su integración con células embrionarias rara vez conduce a la formación de quimeras, en las que, además, nunca se forman gametos con un genotipo de células de teratocarcinoma. Se cree que esto se debe a la aparición frecuente de anomalías cromosómicas en el cultivo de células de teratocarcina: pérdida del cromosoma Y, una variedad de trisomías, deleciones o translocaciones.

Los intentos de distinguir la línea ESC humana se han llevado a cabo muchas veces, pero esta tarea no pudo ser resuelta, ya que los blastocistos humanos normales son objetos de difícil acceso. Además, en los humanos, la frecuencia de anomalías cromosómicas es mayor que en la embriogénesis de los animales. La mayoría predominante de los embriones humanos primarios obtenidos después de la fertilización in vitro muestran un mosaicismo cromosómico caótico y, a menudo, hay aberraciones numéricas y estructurales. Incluso más tarde, en la etapa de blastocisto, solo el 20-25% de los embriones humanos consisten en células con un cariotipo normal. Era casi imposible utilizar dichos embriones para crear un ESC, ya que los cigotos generalmente se cultivaban en etapas de dos o cuatro blastómeros y luego se transplantaban al útero. Recientemente fue una técnica confiable desarrollada para el cultivo de óvulos humanos fertilizados en la etapa de blastocisto. La introducción de esta técnica en la práctica de la fertilización in vitro no solo aumentó la frecuencia del resultado de la implantación exitosa, sino que también convirtió a los blastocistos normales en un objeto más accesible.

Otra fuente de células madre pluripotentes son las células sexuales primarios, que, en contraste con las poblaciones progenitoras más avanzados germenativnogo epitelio, no están en la superficie de beta-integrina, pero expresan alta actividad shelochnoy fosfatasa. Cabe señalar que en el experimento, la población de células madre, que se formaron a partir de células sexuales primarias, se han estudiado desde los años 80 del siglo pasado. Al mismo tiempo, se desarrolló una técnica para aislar células germinales primarias del rudimento de la gónada embrionaria de ratón. Los primeros resultados infructuosos del cultivo de células germinales primarias in vitro sugirieron la desesperanza de estos intentos, ya que las células, aunque sobrevivieron, no proliferaron y murieron dentro de las primeras 24 horas. Más tarde se descubrió que las células germinales primarias de ratón se reproducen in vitro solo en presencia de factores de crecimiento de polipéptidos específicos solubles y unidos a la membrana en el medio de cultivo. Los resultados de numerosos estudios indicaron que la supervivencia y la proliferación de las células germinales primarias requieren la presencia en el medio de cultivo no solo de LIF, sino también de factores de acero solubles (SIF) unidos a la membrana y solubles. Estos péptidos son producidos por las células somáticas de los embriones homocigotos para la mutación Steel, y uno de ellos es el ligando del protooncogen cKit.

Las células germinales primarias de mamíferos y humanos son de origen extragonadal y son la fuente del desarrollo clonal de la línea celular sexual. El comienzo de la línea celular germinal primaria, así como de todos los tejidos del embrión, así como el mesodermo extraembrionario, da el epiblasto (ectodermo primario) de los embriones tempranos, que tiene una organización estructural en mosaico. La eliminación microquirúrgica de varias partes del embrión temprano estableció una zona de localización en el epiblasto de un clon de precursores comprometidos de células germinales primarias. Con la ayuda de la rodamina dextrano, que se usó como marcador celular, se estableció que los precursores de las células sexuales primarias se ubican en la región del epiblasto proximal, junto al ectodermo extra-embrionario. La línea celular sexual primaria emerge del clon de 45 células, cuya asignación ocurre al comienzo de la gastrulación. Luego ocurre la segregación de los clones, y durante la gastrulación, las células sexuales primarias ingresan al mesodermo extraembrionario y se encuentran en la base del brote de alantoides, detrás de la banda primaria. Desde allí, las células germinales primarias migran hacia el extremo ventral del endodermo endocervical y luego se mueven activamente a través del mesenterio, poblando los rodillos genitales al final de la migración. En el proceso de migración, así como en los primeros 2-3 días de localización en el gnomo rudimentario, las células sexuales primarias proliferan activamente y se someten a ocho ciclos de replicación. Si al comienzo de la migración hay alrededor de 50 células germinales primarias, luego en los quistes reproductivos de embriones de ratón de desarrollo de doce días, la cantidad de células sexuales primarias supera los 25,000.

La similitud funcional de los CES y células germinales primordiales demuestra plena integración de este último en la masa celular interna de blastocistos de reemplazo y el posterior desarrollo completo del embrión, el tejido que consisten solamente de los descendientes células germinales primordiales. Según otras características murinos células germinales primarias PGCs también eran idénticas, mostrando la capacidad de diferenciarse en diferentes direcciones, para formar cuerpos embrioides en vitro, a in vivo de forma teratomas cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes se asemejan a ratones testículo teratomas espontáneas línea 129 / ter.

Se establece que, cuando se añade al medio de LIF, y membrannosvyazannogo soluble SIF aislaron células germinales primarias de 8 días embriones murinos sobrevivir y proliferar en cultivo durante 4 días, pero luego mueren. Por otra parte, el período en que la cultura de la muerte observó células germinales primordiales coincide con la etapa de desarrollo de embriones de ratón (12.5-13.5 días), cuando las células germinales femeninas gonadales los brotes primarios entran en meiosis, mitótico y en las células germinales primordiales masculinas son bloqueados división Sin embargo, si se agrega al medio ambiente factores no sólo el crecimiento LIF y de SIF, sino también de FGF2, las células germinales primarias continuar proliferirovat, subcultivos se forman colonias de células que pueden reproducirse incluso después de ser eliminado del entorno de factores de crecimiento (SIF y FGF). Tales células se pueden cultivar durante un largo tiempo sobre el sustrato de fibroblastos embrionarios sin la adición de factor de crecimiento soluble LIF. Son estas líneas celulares estables derivadas de las células germinales primarias que se sugirieron llamar células germinales embrionarias. Este término no puede ser considerado exitoso como cuando, por ejemplo células cultivadas no se pueden obtener las células germinales embrionarias, capaces de llevar a cabo las etapas posteriores de la ovogénesis o espermatogénesis. Esto es debido al hecho de que las líneas de células EG, aunque derivadas de células germinales primordiales, pero en la cultura de la adquisición de las propiedades de las células madre pluripotentes embrionarias pierden su capacidad para cometer la línea germenativnye. En otras palabras, las células sexuales primarias pierden las propiedades de los precursores de gametos en el cultivo y se transforman en células pluripotentes similares a ESC.

Se observa que cuando se administran ratones EG inmunodeficientes, no aparecen teratomas. Se supone que la pérdida de la capacidad de las células EG humanas para iniciar teratomas se debe al hecho de que estas líneas no se crearon directamente a partir de células germinales primarias cultivadas sino que se obtuvieron a partir de células aisladas de cuerpos embrioides. Por lo tanto, es posible que sean descendientes de células pluripotentes, pero ya comprometidas.

Cabe señalar que existen diferencias fundamentales entre las células EG y las células germinales primarias. Esto último no permite obtener embriones de ratón quiméricos, lo que indica la falta de capacidad de las células germinales primarias para integrarse en la masa celular interna o trophectodermo. Las características de la población de células sexuales primarias son más similares a las líneas comprometidas de células somáticas de embriones posteriores, cuya introducción en el blastocisto tampoco conduce a la formación de embriones quiméricos.

Técnicas de modificación de cultivo de los cuerpos embrioides obtenidos con EG-agregación de células permitidos por selección en medios selectivos para recibir otra población de células pluripotentes, llamadas células" derivadas de cuerpos embrioides (células derivadas del cuerpo embrioide - EBD-células). La capacidad de las células EBD para multiplicarse durante un tiempo prolongado en el cultivo permitió crear líneas celulares estables de células comprometidas. Se obtuvieron clones de células que expresan un amplio espectro de ARNm y marcadores proteicos de células especializadas. Este enfoque como resultado demostró que las células pluripotentes humanos de sexo primaria, y se diferencian in vitro en diversos tipos de células: las neuronas, glia, endotelio vascular, células hematopoyéticas, músculo y células endodérmicas.

Fuentes alternativas de células madre embrionarias

La fuente alternativa de líneas ESC humanas puede ser células híbridas. La implantación en el útero de la estructura vacas pseudopreñadas geterogenomnoy obtenido cuando la fusión mediante electroporación fetusa células somáticas humanas con las vacas de huevo, que previamente había sido retirado de la pronúcleo, hace que sea posible la recepción de la masa celular interna de etapas de desarrollo artificiales pre-implantación del embrión. Para esto, el blastocisto del huevo de la vaca con el núcleo trasplantado de la célula humana se obtiene en la primera etapa.

En la segunda etapa, el embrioblast se extrae del blastocisto, y de él, el ESC según el método de Thomson. Es de destacar que los mejores resultados en el aislamiento de las líneas ESC utilizando este método se obtuvieron utilizando núcleos de células foliculares o células germinales primarias que persisten en el cuerpo humano en un estado de hibernación. Esto es debido al hecho de que un huevo de vaca trasplantado células humanas neukorochennye núcleo debe tener alta actividad y telomeazy telómero que evita clones ESC envejecimiento prematuro derivados de huevo híbrido (Repin, 2001). Se sabe que las proteínas EGF con marcador intracelular más importantes son Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, que pertenecen a las llamadas proteínas silenciadoras de la cromatina. Los silenciadores proporcionan un embalaje particularmente compacto de la heterocromatina, que evita la formación de bucles de eucromatina. El paquete de cromatina mediado por estas proteínas se correlaciona con la totipotencia del genoma ESC. Hasta la fecha, se ha establecido que los óvulos maduros de bovinos y humanos son el único tipo de células especializadas que contienen altas concentraciones de proteínas silenciadoras en el citoplasma. Sobre esta base, se desarrolló un método para la producción de ESC híbridas mediante la transferencia de núcleos de células somáticas a óvulos de vacas no nucleares. Los estudios preliminares in vitro han demostrado que el citoplasma de los óvulos de las vacas restablece la totipotencia del genoma del núcleo de la célula somática humana en 12-24 horas de cultivo.

De particular interés son los datos sobre las características del desarrollo preimplantacional de embriones humanos, que indican un reemplazo posterior de células totipotentes por una población de células pluripotentes que en ratones. El estudio de las transformaciones celulares mostró que las células de la masa celular interna del blastocisto humano, además de las ESC, también generan células de trofoblasto, lo que indica su potencia total.

Se sabe que en la etapa del blastocisto hay dos poblaciones celulares comprometidas de manera diferente. Uno de ellos es la capa externa del blastocisto, el trofectodermo, derivado de las células del trofoblasto y otros componentes embrionarios de la placenta. La segunda población de células se agrupa en una masa densa que entra en contacto con la superficie interna del trophectodermo. La población celular de la masa celular interna se deriva de todos los tejidos y gérmenes de los órganos embrionarios. En la etapa del blastocisto tardío, se forma un endodermo extra embrionario a partir de la masa celular interna y se forma un epiblasto (el ectodermo primario). Al mismo tiempo, las células del epiblasto retienen la pluripotencia, mientras que la capacidad de diferenciar las células del endodermo extra germinal es limitada.

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Obtención de células madre embrionarias humanas

Hasta hace poco se creía que el trofoblasto obtiene a partir de hESCs imposibles. Células madre de línea trophectoderm Sin embargo diploides aisladas de blastocisto en un medio que contiene, en lugar de LIF y heparina FGF2, prolifera y se transforma en células madre. Si se quita de en medio de FGF2, las células dejan de trophectoderm reproducción, comienzan endorreduplicación de los cromosomas y los elementos celulares trofektodermalnye transformado poco a poco en un gigante de las células del trofoblasto. Probablemente, LIF no estimula la proliferación de células trophectoderm debido al hecho de que FGF2 desencadena una transsignalizatsii mecanismo como FGF2, la unión a receptor citoplasmático (FGFR2), activar la MAP quinasa en el citoplasma - ERK1 y ERK2. En consecuencia, cuando se incorpora en las células del blastocisto de una vía de señalización (LIF - gpl30 - JAK-quinasa - STAT3) células de la masa celular interna se transforman en hESCs pluripotentes, mientras que la activación del segundo mecanismo de la señalización transmembrana (FGF2 - FGFR2 - MAP quinasas ERK1 / ERK2) células en el trophectoderm blastocisto formado tallo. La selección de la vía de señalización, a su vez, depende de la actividad de la Oct4 gen. Este dominio POU gen pertenencia, situado en el locus t 17 autosomas y se expresa durante la ovogénesis, en período de trituración, así como en células de la masa celular interna del blastocisto, y en las células germinales primordiales. Gen papel Oct4 funcional se codifica un factor de transcripción necesario para la aparición de células pluripotentes, su diferenciación y desdiferenciación.

La expresión del gen oct4 en la ESC varía dependiendo de la interacción de este factor de transcripción con los cofactores. Una regulación direccional de la expresión de oct4 en blastocistos mostró que cuando su actividad disminuye, la mitad de las células forman un trofodermo, mientras que con un aumento en la expresión inducida de oct4, ocurre predominantemente ESC.

En el experimento, ESC no se puede convertir en una línea al cultivar blastómeros totipotentes en la etapa de trituración, así como en la etapa de gastrulación y etapas posteriores del desarrollo embrionario. Las CME del ratón generalmente se asignan en el día 3.5-4.5 del embarazo, que corresponde al sexto (blastocito de una capa) y la séptima etapa (un blastocisto de dos capas, un cilindro de óvulos precoz) de la embriogénesis normal. Obviamente, solo en el período de preimplantación, los embriones de ratones contienen poblaciones celulares que pueden transformarse en ESC. En consecuencia, el aislamiento de las líneas ESC solo es posible en ciertas etapas de la embriogénesis. Totitipotentes, desde el punto de vista de la posibilidad de desarrollar un embrión viable con membranas embrionarias y placenta, son el zigoto y los blastómeros que surgen durante la trituración. La pérdida de la potencia total de las células germinales comienza en la etapa tardía de la mórula, cuando la fragmentación adicional de blastómeros depende de su ubicación. Los primeros blaetómeros de Morula retienen la totipotencia, porque las manipulaciones experimentales con cambios en su ubicación, por ejemplo, la inversión de su ubicación, no previenen el desarrollo de un embrión completo.

Se encontró que la eficacia de la liberación de ESC en la línea se ve afectada por el estado de los blastocistos en el momento de su explantación. El uso de blastocistos después de modelar una diapausa de siete días en el tracto genital de ratones ovariectomizados en el día 3.5 del embarazo y la progesterona promueve una asignación más exitosa de las líneas de células madre embrionarias. Se supone que bajo tales condiciones aumenta el número de blastómeros que forman la masa celular interna. También es posible que el ciclo celular se extienda y que la mayoría de los blastómeros entren en la fase G0.

Por otra parte, la creación de líneas de células madre pluripotentes estables depende de los embriones genotipo: bastante distinguen fácilmente de los CES murino blastocistos línea 129, es significativamente más difícil de obtener utilizando ratones CS7BL / 6 y prácticamente imposible aislar la línea desde hESCs blastocistos ratones CBA / Ca. Obviamente, los embriones tempranos poseen algunas características genéticas que afectan el desarrollo de la línea ESC pluripotente. Sin embargo, cuando epiblasto cultivadas con aislamiento, así como por la selección selectiva la diferenciación de la línea celular hESCs de embriones tempranos ratones CBA / Ca todavía estaban asignados.

Una técnica estándar comprobada para la obtención de líneas de ESK a partir de blastocistos se ofrece en manuales de laboratorio sobre la técnica del experimento con embriones tempranos. También se pueden obtener líneas ESK experimentales cultivando un epiblasto aislado (ectodermo primario) de embriones de ratón de 4,5 días con una técnica microquirúrgica bastante compleja y condiciones de cultivo modificadas. La complejidad de este procedimiento está justificada, ya que la frecuencia de formación de líneas ESC fue mucho mayor que en el trabajo con la masa celular interna del blastocisto.

Para aislar las líneas ESC, cada clon se transfiere a un micropocillo, se produce un agregado de 40-60 células y se dispersa nuevamente. Múltiples repeticiones de este procedimiento permite obtener línea ESK inmortalizada con células normokariotipnyh máximos tasa de proliferación unidos al plástico, que a través de pasajes 50-100 retienen actividad alta telomerasa totipotencia y. En el proceso de apoyar las líneas de ESC, la contaminación del medio ambiente o del suero con endotoxinas bacterianas es la más peligrosa, incluso las concentraciones mínimas de endotoxinas en el medio de cultivo causan la muerte masiva de células germinales inmaduras. Con un control cuidadoso de la crecimiento lineal y la dispersión puntual de los CES en cultivo son capaces de fisión simétrica, en la que ambas células hijas permanecen pluripotentes y capaces de realizar un número ilimitado de ciclos celulares, manteniendo un cariotipo diploide y la potencia total.

La selección de una población limpia de ESC humanas puede realizarse después de la transfección en su genoma de moléculas de ADN recombinante que contienen un gen que codifica la síntesis de una proteína fluorescente verde (GFP). La expresión de GFP aumenta con el crecimiento de ESC en condiciones que apoyan su proliferación, mientras que con el inicio de la diferenciación, el nivel de expresión de este gen se reduce, lo que permite la selección de líneas celulares pluripotentes estables puras en un medio selectivo. Cuando se cultiva con selección de GFP de ESC, la frecuencia de colonias aumenta mucho, ya que en las condiciones de los cultivos de selección se elimina el poderoso efecto antiproliferativo de las células diferenciadas.

Traducción de células madre embrionarias humanas en línea por medio de su método de aislamiento de los embriones de preimplantación (paso 80-120 células), que permanecen después de la vitro procedimiento de fertilización in. Para esto, los embriones "excedentes" obtenidos artificialmente se dispersan mecánicamente en el entorno Delbecco-Needle. Después de que las células se marcan con anticuerpos monoclonales selectivos con un marcador fluorescente, se aíslan las células del embrioblast. El embrioblast se dispersa en células individuales usando una mezcla de disaspasa-colagenasa. Las células disociadas se cultivaron en un medio especial (+ suero de ternera fetal 20% de medio Delbekko 80% en presencia de 500 g / ml de IL-6, LIF y SCF) sobre la monocapa de fibroblastos de embriones de alimentación 3 primeros pasajes. En este caso, la supervivencia y la proliferación de células madre y progenitoras se ve respaldada por la exposición a IL-6, LIF y SCF. En dicho entorno, las ESC crecen mediante clones en suspensión de células raspadas no unidas, que deben disociarse mediante pipeteo múltiple suave. Aparecen nuevos clones en el cultivo suspendido en el día 5º al 7º. La tasa máxima de crecimiento de ESC se logra mediante la disociación repetida de clones en la etapa de 10-15 células. Luego, cada clon se transfiere a una microcélula y se cultiva a un agregado de 40-50 células. El procedimiento se repite muchas veces en pasajes, aumentando el volumen de cultivo a una densidad de 5-10 millones de células por taza de 6 centímetros. Mediante el uso de tales pases un Thomson fue aislado de 10 clones humanos CES inmortales que a través de pasajes 100 retienen actividad alta de la telomerasa, la capacidad de proliferación intensa y características fenotípicas potencia total mínimo, con la diferenciación en cualquiera de las 350 líneas de células especializadas que se derivan ecto-, meso- - y endodermo La diferenciación de ESC humana comenzó (en cambio de medio, la adición y eliminación de LIF suero) con fijación de las células al sustrato, lo que indica el desarrollo del citoesqueleto y la expresión de receptores de adhesión. Es importante que con la proliferación irrestricta de ESC humanas, se conserve un cariotipo normal.

El segundo método para aislar líneas ESC humanas se basa en el uso de células sexuales primarias. Los estudios experimentales han demostrado que las líneas de células Eu se pueden obtener a partir de las placas genitales de embriones de ratones de 12,5 días de edad. Sin embargo, en estos casos, la frecuencia de formación de las líneas celulares progenitoras fue significativamente menor que en los experimentos con embriones anteriores. Al mismo tiempo, las células sexuales primarias de las gónadas de los embriones de ratón de 13,5 días de edad gestacional generalmente son incapaces de transformarse en líneas.

Las primeras líneas estables de células EG humanas pluripotentes se obtuvieron a partir de gonocitos primarios aislados de los brotes genitales de embriones de 5 a 9 semanas de edad. Las células aisladas se cultivaron sobre un sustrato de fibroblastos embrionarios de ratón inactivada en medio DMEM con suero fetal, a la que se añadió mercaptoetanol, forskolina, así como factores de crecimiento humana recombinante (FGF y LIF). Después de 7-12 días, las colonias multicelulares aparecieron en cultivo, de acuerdo con las características morfológicas y los marcadores moleculares correspondientes a las células EG humanas. Después de la agregación, estas células formaron cuerpos embrioides, con el desarrollo posterior del cual aparecieron células especializadas, características de los derivados de las tres hojas embrionarias. A lo largo de 10-20 pasajes, las líneas de células EG retuvieron el cariotipo normal y no perdieron la pluripotencia.

También se muestra que el efecto combinado de LIF, factores de acero solubles y ligados a la membrana, así como TGF-b, modifica el programa para el desarrollo de células germinales primarias. En lugar de detener las divisiones mitóticas y comenzar a diferenciarse hacia la ovogénesis o la espermatogénesis, las células sexuales primarias continúan proliferando. Después de varios ciclos mitóticos adicionales, se vuelven similares a las células del epiblasto y, al perder las propiedades de los precursores de las células germinales, se transforman en células EG embrionarias pluripotentes.

Por lo tanto, en 1998, las líneas inmortalizadas de células sexuales primarias se aislaron por primera vez del rudimento sexual del tejido de autopsia fetal humana. La embriogénesis de células germinales primarias humanas aparecen en el saco vitelino en la tercera semana del desarrollo, y en las semanas 4-5 de estas células migran hacia la zona del tubérculo sexual, donde forman una población de gonocitos dormantnye primarios. En el estado inactivo, las células germinales primarias permanecen en el brote hasta el nacimiento. Líneas de células germinales primarias se extrajeron desde el tubérculo genital embriones 5-9 semanas de edad fetales recuperadas tejido ex tempore que se trata con una mezcla de colagenasa tipo IV-V, la hialuronidasa y DNasa para el rendimiento de aumento celular cuantitativa y cualitativa. Las células germinales primarias en los tejidos del tubérculo genital fetal están rodeadas por células del estroma de Sertoli (mesenquimales). Propósito funcional de las células de Sertoli es la producción de factores anti-apoptóticos (Fas-ligando), mitógenos, y agentes inmunosupresores que protegen las células madre sexuales de ataque inmunológico por el cuerpo. Además, el microambiente estromal del tubérculo genital juega un papel importante en la maduración de los gametos. Las células germinales primarias aisladas se plantan en el cultivo sobre la capa estromal alimentadora que consiste en los fibroblastos fetales de los tres primeros pasos. La combinación más eficaz de mitógenos se reconoce como un complejo que consta de LIF, FGF y la forskolina (estimulante formación de AMPc). Células germinales primordiales proliferación in vitro requieren la adición de suero fetal, en presencia de un primarios gonocitos de reproducción en los clones de cultivo acompañados por la formación de células globulares, no adherentes al sustrato.

Los Institutos Nacionales de la Salud sobre la base de resumir la información existente sobre los métodos de asignación de líneas ESC humanos de los blastocistos se hizo una conclusión preliminar de que es más probable cuando los blastocistos cultivados con masa celular interna bien formada (Las células madre de la asignación exitosa de la CES: el progreso científico y futuras líneas de investigación Nat. Inst, de Health USA). Desde este punto de vista, la mejor fuente de los CES para crear líneas son blastocisto humano quinto día de desarrollo, de los cuales la asignación de la masa celular interna se debe retirar con cuidado trophectoderm. Masa celular interna aislado que consiste en esta etapa de 30-35 células debe ser cultivada en un sustrato de fibroblastos embrionarios murinos, lo cual es una condición decisiva para la formación de colonias en cultivo hESCs.

El análisis de las características fenotípicas de las células madre embrionarias

De particular interés es el análisis comparativo interespecífico de las características fenotípicas de ESC. Se encontró que las colonias ESC Humanos - Una densos racimos de células epiteliales aplanados, mientras que los ratones de la pantorrilla embrioide constan de conglomerado suelto de células redondeadas. En la ESC humana, el índice de la relación nuclear-plasma es más bajo que en la ESK de ratón. Las células madre embrionarias de los monos forman colonias de células planas con bordes irregulares. En los primeros clones de los primates ESC, las células individuales se ven fácilmente. La ESC proliferante de todas las especies animales estudiadas no expresa las moléculas MHC de la primera y la segunda clase. Al mismo tiempo, los CES humanos dan una respuesta positiva a anticuerpos TERA 1-60 y GCTM-2, lo que indica la presencia en sus células madre -kartsinomnyh queratina superficie / proteoglicanos de sulfato de condroitina, característico de embrionario (teratomas). La expresión en hESCs todo tipo de gen Oct4 animales sugiere que, a pesar de las diferencias fenotípicas en las CME humanas y de ratón, aparentemente activada por el mismo conjunto de genes responsables del mantenimiento de la pluripotencia (Perú, 2001). Además, las líneas ESC derivados de ratas embrionarias, cerdos, conejos, primates, y ganado, tienen características morfológicas similares, un conjunto similar de identificación molecular de los marcadores y un mecanismo molecular casi idéntico para la ejecución del programa de la embriogénesis que le permite tomar una nueva mirada a la cuestión xenotrasplantes .

A diferencia de la embriogénesis normal, in vivo, la proliferación in vitro de hESCs no se acompaña de la formación de capas germinales y procede al bloque fondo homeóticos Nohgenov, es decir, sin la organogénesis. Puesto que los genes de segmentación no funcionan en la cultura hESCs imposible de reproducir dichos períodos embriogénesis como la segmentación somite pestaña del núcleo, la formación del saco vitelino, alantoides órganos y tejidos provisorios y otros. Los CES de cultivo se congelaron al comienzo de la formación de 350 líneas de restricción de células especializadas. Así, las células progenitoras clon subsidiarios y PGCs localizadas centralmente son solamente embrión modelo durante el desarrollo en el que se forman diferentes regiones de tejido en una sola etapa son diferentes de células especializadas derivados, sin embargo, a partir de precursores comunes. Aunque el nivel mínimo de receptores en la superficie de hESCs, conservan la capacidad de realizar procesos morfogenéticos primitivas que simulan el grueso de la estructura de embrión temprano: hESCs suspensión en la cultura y agregados forma una estructura parecida a blastocisto o incluso más tarde los embriones (cilindros de huevo). Dichos agregados de suspensión se denominaron apropiadamente cuerpos embrioides simples y complejos.

Cuando se mezcla diferenciar en diversas células del cuerpo embrioide expresadas simultáneamente por genes ectodermo temprano (oct3, FGF-5, nodal), endodermo (gata-4), mesodermo (brachyury), mesodermo cardiogénico (pkh-2,5), el tubo neural (msx3 ) y hematopoyesis (elkf). Usando varias combinaciones de citoquinas y factores de crecimiento para dirigir la formación de células de la capa de germen in vitro en un número de casos fue posible obtener cuerpos embrioides, que se expresa preferiblemente genes ectodermo o mesodermo, que abre el camino a la modelización de la gastrulación y la fase de organogénesis temprana.

El crecimiento clonal de hESCs es evidencia de la división celular asimétrica en la que sólo una de las ESC en el clon centro conserva no limitativo capacidad de reproducción, mientras que la otra célula hija da lugar a la generación de células progenitoras, la diferenciación ya está entrando. Por lo tanto, la tasa de multiplicación del clon en la periferia del cuerpo embrioide es mayor que en el centro. Las células marginales del clon en crecimiento experimentan una diferenciación desordenada espontánea, migran o mueren por los mecanismos de la apoptosis. Estos eventos determinar el destino del clon de si la tasa de proliferación superior a la tasa de la migración y de la muerte celular apoptótica, clon tamaños continúan aumentando, la estabilización se produce con igual apoptosis y la tasa de formación de nuevo velocidad de la célula, la regresión - la relación inversa de estos procesos. Las células progenitoras se dividen simétricamente, es decir, ambas células hijas se diferencian aún más en líneas celulares especializadas maduras. La proporción de ESC / células progenitoras varía, pero siempre la cantidad de ESC es solo una fracción de un porcentaje de la población de células progenitoras. Por lo tanto, solo el pipeteo cuidadoso y la desagregación oportuna de los clones pueden aumentar el número de ESC en cultivo. Para obtener el rendimiento máximo de ESC, el más efectivo fue la desagregación de los clones en la etapa de 10-12 células. La dirección y el grado de diferenciación de las células en el cuerpo embrioide depende de su ubicación. Las células del cuerpo embrioides exterior no expresan el gen y oct4 experimentan diferenciación en células de endodermo primarios de los que posteriormente forman células epitelioides y parietal extraembrionario endodermo visceral. Las células internas del cuerpo embrioide expresan el gen oct4 y retienen la pluripotencia durante 48 horas de cultivo. Pero entonces la reorganización morfológica se produce en el cultivo en monocapa epitelial comienza y la expresión de los genes que controlan el desarrollo del ectodermo primario. Luego comienza el proceso de citodiferenciación desordenada total con la aparición de varios tipos de células que son los derivados de las tres hojas germinales. En el proceso de diferenciación espontánea de las células del cuerpo embrioides primera surgir agregados marcadores endodermo en forma de fragmentos (quistes) saco vitelino. Además, angioblastos y células endoteliales de capilares en crecimiento aparecen en estas estructuras. En las etapas finales de la diferenciación espontánea de las células internas del cuerpo embrioide desarrolla diversas células diferenciadas terminalmente, incluyendo neuronas, elementos gliales, cardiomiocitos, macrófagos y eritrocitos. En cierta aproximación (teniendo en cuenta la inversión espacial de láminas que forman el tejido embrionario) a través de los cuerpos embrioides en vitro pueden explorar procesos morfogenéticos y analizar los mecanismos moleculares de período inicial citodiferenciación embrionario, y establecer el papel de genes específicos en la implementación de estos procesos.

Por lo tanto, dentro del clon hay células en las que se descubren diferentes programas de desarrollo genético: ESC, progenitores tempranos y poblaciones de progenitores diferenciadores. El cultivo de ESC por los métodos de caída de gota o cultivo de masa sin una capa de alimentación y sin la adición de LIF en el medio conduce inevitablemente a la formación de cuerpos embrioides. La morfología de las células de las capas externa e interna de los cuerpos embrioides es diferente. La capa externa consiste en grandes células de proceso. Su superficie, orientada al medio ambiente, está cubierta de numerosas microvellosidades. La capa externa de las células está separada de la membrana basal interna que se asemeja a la membrana Reichert, mientras que las células de la capa interna de los cuerpos embrioides son un epitelio cilíndrico. Morfológicamente, la capa interna, aunque contiene muchas células en división, recuerda más a las colonias ESC indiferenciadas.

Características de las células madre embrionarias humanas

Ausencia de interacciones del parénquima-mesénquima en la señal de fondo el bloqueo de los genes homeosis causa el crecimiento desordenado de las PGC en cultivo, ya que esta pestaña se rompe y los órganos provisorios de infraestructura formación. Crecimiento desorganizado y diferenciación espontánea desordenada de hESCs en cultivo debido a la falta de marcado marco del estroma de los órganos de futuras mesenquimales: in vitro es posible la formación de millones de hepatocitos, pero no se puede obtener cualquiera de los segmentos del hígado, incluyendo tales elementos estructurales y funcionales, tales como los senos paranasales, el espacio de las células de Disse y de Kupffer.

Se cree que la pluripotencia de las ESC se dio cuenta exclusivamente en la embriogénesis para formar tejidos y órganos del embrión, mientras que el cordón umbilical y la placenta se derivan trofoblasto. Encerrado en una cáscara trofektodermalnuyu ESK generar consistentemente clones de células provisorio programa de desarrollo de la realización de por mRNA combinatorias mayor de matriz topográfico Nohteyaov, que predeterminan la disposición espacial, forma, dimensiones, número de células de órganos provisionales y definitivas y montaje parénquima en unidad estructural y funcional. Al mismo tiempo la ESC son el único tipo de célula en la que el mecanismo molecular de la realización de sus potenciales completamente disociado del programa genético de desarrollo y empresas de servicios energéticos se ven privados de la posibilidad de interacción con otras células, debido a la obstrucción de las dos percepciones de los receptores y sistemas de transsignalizatsii. Sin embargo, adecuados CES activación da como resultado la embriogénesis gradual despliegue nacimiento poner fin al programa está completamente formado y listo para la vida extrauterina de un organismo compuesto por mil millones de células. En este corto tiempo, pero la deuda inimaginable en la trayectoria espacio inevitable ocurrencia celular de errores en los mecanismos moleculares que proporcionan funciones vitales de las células, y en los programas que controlan su proliferación, la diferenciación y la especialización. Por lo tanto, en la farmacogenómica moderna, consideramos por separado las enfermedades de la estructura molecular y la enfermedad de la programación celular. Y la acción de la mayoría de los nuevos fármacos dirigidos a corregir el nombre del programa de diferenciación, proliferación y la organogénesis, así como la regeneración de órganos y tejidos. En el organismo adulto a través de los CES se hace posible controlar el comportamiento de las células madre / progenitoras trasplantadas en el cerebro, hígado, bazo, médula ósea y otros órganos del humano para reparar un órganos parenquimales receptores dañados debido a células mesenquimales donante diferenciación y especialización matriz conservados. En esencia, el programa de totipotencia es el lanzamiento de otro genoma de ovocitos, cigotos y nivel blastómeras, pero estas células no es todavía posible clonar y se pasaron en las cantidades necesarias para las necesidades de la medicina experiencial y práctico. Por lo tanto, el CES es una fuente única de la información genética que contiene el mapa tridimensional lineal restricción del embrión y los códigos de líneas celulares especializadas durante la gastrulación.

Prácticamente posibilidades ilimitadas de ESC regenerativa debido al hecho de que su genoma, en contraste con el aparato genético de células somáticas diferenciadas, mantiene la pluripotencia. Una manifestación de estado latente arraigada en la información genética CES es el llamado fenotipo mínimo - en la superficie del CES de expresar un número limitado de receptores, y por lo tanto desplegado muy pocos programas para interactuar aparato nuclear transsignalizatsii de la célula con su microambiente. En el contexto de los genes responsables de la hibernación de la restricción de líneas de células especializadas y diferenciación de las células, sólo alrededor de 30 de los 500 genes cuyos productos proporcionar células de comunicación con el microambiente que rodea activado. Utilizando el método de análisis en serie de la expresión génica demostrado que la generalidad de las cajas funcionales del genoma principales que regulan la energía y el metabolismo en las células somáticas y los CES en la última cantidad extremadamente baja determinada de ARNm de los receptores, proteínas G, segundos mensajeros, transcriptasas, cofactores expresión y represión , es decir, todo el sistema de transferencia transmembrana de la señal reguladora a la célula. Esto se debe a la falta o muy baja expresión de genes de transsanalización. Durante la diferenciación inducida en el genoma de ESC 18 operación se detiene de forma sincrónica funcionando genes para el fondo activación transsignalizatsii 61 gen que controla la síntesis de receptores de adhesión celular, componentes de la matriz extracelular, la restricción transcriptasas elementos messendzhernyh y el sistema de transmisión de señal para una unidad nuclear con los receptores de membrana de células plasmáticas. Simultáneamente bloqueado expresión de genes responsables de la síntesis de proteínas silenciadores, así como la expresión de genes koingibitorov proporcionar hESCs genoma totipotencia.

Se encontraron marcadores genéticos para las células de los tres folíolos embrionarios. Identificación capa de células ectodérmica llevado sobre la expresión de genes nodal, oct3 y FGF-5, las células mesodérmicas - brachyury gen, zeta-globina, endodermo - en gata-4 la expresión génica. En la embriogénesis normal, durante la gastrulación observado una migración activa de las poblaciones inmaduras de las células madre y progenitoras, las áreas de los huesos faciales del cráneo designar localmente, algunas partes del cerebro, el sistema nervioso periférico, sistema de conducción cardíaco y el tejido del timo que se forman a partir de clones de células desplazadas. Marcado de células genes tempranos capas germinales hace que sea más fácil para el análisis topográfico de la migración de las células progenitoras en el embrión en desarrollo. Se encuentra, en particular, que las células en la expresión de P19 agregados embryocarcinoma de la primera brachyury gen mesodermo comienza durante la reducción de la expresión génica del activador de plasminógeno de tejido, a-fetoproteína, queratina 8, y la queratina 19, que son marcadores de las poblaciones migratorias temprano del mesodermo. En consecuencia, la formación de tejidos de origen mesodérmico comienza sólo después de que el proceso de células mesodérmicas progenitoras de migración y de punto de sedimentación.

Con las características fenotípicas muy limitados y la ausencia de la mayoría de los bloques transsignalizatsii CES, sin embargo, expresar algunas moléculas receptoras que pueden utilizarse para identificarlos. Es digno de mención que los antígenos-marcadores de ESC en humanos y primates fueron comunes. Lo más a menudo utilizado para hESCs etiquetado etiquetados anticuerpos a los antígenos membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (antígenos lipídicos únicos que representan GL7 glicolípido complejo con ácido siálico), así como las glicoproteínas de alto polímero TRA-1-81, Tra-1-60. Además, hESCs expresan antígeno específico embrionario SSEA-1 y fosfatasa alcalina endógena, así como un factor de transcripción específico Oct4. Este último es necesario para el mantenimiento de los mecanismos de proliferación hESCs - factor de transcripción específico del gen Oct4 activa la expresión de factor de crecimiento fibroblástico 4 la expresión génica y estabiliza el boxeo responsable de no limitativo reduplicación del ADN en células inmaduras. Las más importantes son las proteínas marcadoras intracelulares Oct3, Oct4, el Tcf y Groucho, en relación con las proteínas de la cromatina-silenciadores.

Casi inmediatamente después de los de largo plazo CES intentos cultivadas no tiene éxito y el organismo se preparó primero mediante el cultivo de células madre aisladas a partir de blastocistos de ratón, y cultivo de células germinales primarias, iniciado estudios de capacidad ESC pluripotencia etapa cuando se administra en las primeras etapas del desarrollo del embrión. Se demostró que en la mórula y blastocisto PGCs son capaces de formar embriones quiméricos en los que los descendientes CGP de donante detectó en todos los tejidos somáticos e incluso en gametos. Así, en Developmental Biology usando ESC scripting "puente" entre los estudios experimentales in vivo e in vitro, lo que aumentó significativamente la posibilidad de estudiar procesos Marcadores tejidos primarios y órganos, su diferenciación y organogénesis embrionaria.

Está claramente establecido que in vivo en el proceso de embriogénesis, las ESC se integran en la masa de células germinales tempranas, y sus derivados se encuentran en todos los órganos y tejidos. Las ESC colonizan en el embrión quimérico una línea de células sexuales, cuyos descendientes forman óvulos completos y espermatozoides. Las células madre embrionarias son clonogénico - PGCs individuales pueden crear genéticamente idéntica a una colonia de células con marcadores moleculares, que incluyen la expresión de Oct4 gen y fosfatasa alcalina, alta actividad de la telomerasa, así como la expresión de antígenos embrionarios específicos.

Para estudiar los mecanismos de la embriogénesis utilizando la técnica de hESCs mórula quimerización mediante la creación de una estructura biológica, que se encuentra fuera de la capa blastómeras tetraploides receptores y donantes PGCs se administran en. Por lo tanto, trofoblasto formado a partir de descendientes blastómeras tetraploide receptor que permite la implantación y placentación, y CGP de donante que actúan como la masa celular interna, que se forma a partir de una línea germinal viable de los gametos del cuerpo y progenitoras primarios. Valor Estudio de ESC no sólo radica en que, cuando la manipulación in vitro con su genoma retenido pluripotencia, sino también en el hecho de que mientras que la conservación de la capacidad de participar en la formación de hESCs células germinales primordiales en el embrión quimérico. Se muestra que sólo una descendencia de PGCs modificados genéticamente colonizar todos los gérmenes primaria y forma de tela embrión quimérico obtenido por agregación o cocultivo de las células con embrión de 8 células. Cuando se trasplantan en CES ratones mórula transfectadas con gen de la proteína fluorescente verde, se encontraron descendientes fluorescentes de las células en todos los tejidos investigados del embrión en desarrollo (Shimada, 1999). El trasplante de ESC en la mórula permite la creación de ratones viables, cuyo cuerpo consta únicamente de los descendientes del CES donante, lo que abre perspectivas para diversas opciones de clonación terapéutica. Ahora bien, este enfoque metódico se utiliza con éxito para estudiar los problemas de la biología del desarrollo, en particular, analiza los mecanismos de inactivación genética del cromosoma X o la inestabilidad epigenética de la ESC. El trasplante de ESC en el embrión temprano también se usa en biotecnología en la agricultura, así como en experimentos de terapia genética.

Los trasplantes de ESCs genéticamente modificados se usan para evaluar las células diana de los genes mutantes. Las ESC cultivadas in vitro se usan en biotecnología para crear ratones knockout. Para hacer esto, mediante recombinación homóloga, el gen que se va a examinar se elimina de la ESC, y las células que carecen de este gen se aíslan en medios selectivos. Luego, se inyectan ESCs knockout en el blastocisto o se agregan con blastómeros de mórula. Los principios de los embriones quiméricos obtenidos de este modo se trasplantan en una hembra receptora y ratones recién nacidos seleccionados entre los individuos con gametos, nullizigotnymi de este gen. Con esta tecnología, se han creado muchas líneas de ratones knock-out, que son ampliamente utilizados en biología experimental y medicina experimental. En dichos modelos biológicos, se estudia la importancia de ciertos genes en el desarrollo embrionario, así como su papel en los mecanismos de las enfermedades y las condiciones patológicas del hombre. Además, las líneas de animales knockout se utilizan en la fase de prueba preclínica de nuevos métodos de terapia génica. Por ejemplo, utilizando la transfección de genes en ESK alelo normal del gen mutante es propietario corrigió eficazmente mutación, llama la atención el sistema hematopoyético. La introducción de genes extraños en ESC permite la creación de líneas de animales de laboratorio transgénicos homocigotos a un ritmo acelerado. Sin embargo, cabe señalar que la técnica dirigida recombinación génica eliminación fiable funcionó como sin embargo, sólo relativamente ratones DESC. Uso de los CES murinos doble knockout instalado grupo funcional papel área de genes en el cromosoma 7 (región genómica copia cromosoma 19 minutos humano), y la parte proximal del cromosoma 11 (copiar cromosoma 5d humano) - eliminación de estos genes en Los ratones ESK permitieron evaluar la función de sus análogos en humanos.

Los estudios de la función de capacidad de los genes de embriones humanos, la transfección en el gen que animales de laboratorio permitieron hESCs en particular, crypto aclaran el papel del gen en la lengüeta y que forman el gen mesodermo cardiogénico, Pax-6 - en el ojo embriogénesis. Constituye la primera expresión de los genes en la tarjeta de proliferación inmadura ESC teratocarcinoma y los ratones blastocisto confirmó la represión abrumadora en los genes transsignalizatsii ESK. La combinación de los CES mutantes 60-80 y 20-30 células de embriones de ratón normales pre-implantación conduce al desarrollo de embriones quiméricos en los que bookmarks cuerpos están compuestos de células donantes y receptoras, que nos permite determinar el papel de los genes desconocidos en la gastrulación y organogénesis. Mapa funcional del gen de desarrollo de embriones de ratón detalles ampliados de la función de gen pestaña sf-1 en la glándula suprarrenal y primordios genital, en peso 1-gen - en los riñones genes de la familia pestaña MyoD - en la pestaña de la familia de genes músculo esquelético gata-1-4 - en la maduración de restricción rudimentos de eritro y linfopoyesis.

Dirigida fuera de alelos maternos y paternos de los genes en hESCs utilizando recombinasa vector servido para aclarar las funciones de varios genes durante la embriogénesis y la tecnología a principios de orientación de los genes desconocidos humanos en ratón CES contribuir al descubrimiento de nuevos genes mutantes responsables del desarrollo de enfermedades hereditarias graves. Utilizando el método knockout define significado obligado de algunos genes para la colocación de los tejidos embrionarios: gata-4 - para el infarto, gata-1 - a eritroides tejido hemopoyético, myoD - músculo esquelético, brachyury - para la restricción mesodermo transcriptasas Hnf3 y HNF4 - para células madre de hígado, el GAR-2 - marcadores para clones de linfocitos T y B (Repin, 2001). Doble eliminación de los genes en hESCs ha abierto el acceso al estudio del papel funcional de los genes de las capas germinales, segmentación y homeosis y trasplante ESC dada la posibilidad de obtener embriones híbridos interespecíficos viables. Con la mejora de los métodos de trasplante de CGP de donante en un único embrión de 8 células demostrado que quimerización en el nivel celular de muchos órganos del embrión receptor. Tenga en cuenta que los brotes de células se encuentran en el tejido órganos ratones receptores humanos después de la administración de las células madre hematopoyéticas humanas en un blastocisto. Se encontró que en embriones de ratón durante la formación de los cuerpos de sangre hESCs pluripotentes circulantes. Es posible que su función biológica esté en la organización embrionaria del futuro sistema inmune. Con ESC in vitro reproducido modelos adecuados de enfermedad genética humana: modelos knockout doble gen de la distrofina en ratones de la distrofia muscular de Duchenne, el gen de apagado atm (control señal de síntesis quinasa cromatina) - ataxia-teleangektaziyu. En este caso, una enfermedad hereditaria mortal en niños debido a defectos en la reparación del ADN se desarrolla degeneración de las células de Purkinje en el cerebelo, que se acompaña de una involución del timo debido a la muerte de las células proliferantes. Clinic, fisiopatología y patomorfologija tazii ataxia-teleangek- reproducidas a través de la introducción en la información genética anormal ESC de quimeras ratones corresponden a los de los humanos. Además ataxia-teleangektazii usando PGCs y ratones knockout desarrollado modelo experimental, algunas enfermedades humanas homocigotos hereditarios asociados con trastornos del metabolismo de carbohidratos y lípidos, el catabolismo de los aminoácidos, la eliminación de cobre y la bilirrubina, que aumentó significativamente la posibilidad de la medicina experimental para los ensayos preclínicos de nuevos métodos para tratar enfermedades relevantes derechos.

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El uso de células madre citohíbridas

Las células híbridas obtenidas por fusión de células somáticas de hESCs, son modelo adecuado y prometedor para el estudio de la pluripotencia de células madre y la reprogramación de los cromosomas de células diferenciadas. Tsitogibridy obtiene por la fusión de ESC con células diferenciadas del animal adulto, proporcionar una oportunidad para estudiar la relación entre los genomas de diferentes "edades": se desarrolla una situación única, donde los cromosomas homólogos derivan de células de varias etapas de diferenciación, y diferentes grados de madurez, están en el mismo núcleo, donde puede fácilmente transdeystvuyuschimi compartir señales reguladoras. Es difícil prever cómo reaccionará tsisregulyatornye sistema epigenético de cromosomas homólogos existente durante yn desarrollo dividual, en respuesta a las señales transdeystvuyuschih impacto de genomas relacionados embrionarias. Además, en las células híbridas se produce la segregación del cromosoma parental que permite estudiar la interacción de los genomas a nivel de cromosoma separado, es decir, potencialmente identificar la parte de cromosomas específicos en el mantenimiento de la pluripotencia, o por el contrario, una salida en diferenciación.

Como primer modelo experimental para estudiar la interacción de genomas con diferentes "antecedentes de desarrollo", se usaron citohíbridos obtenidos mediante la fusión de teratocarcinoma pluripotente y células somáticas diferenciadas. En algunos casos, tales células híbridas conservan propiedades pluripotentes a un nivel suficientemente alto. En particular, las células híbridas teratocarcinoma-somáticas in vivo indujeron el desarrollo de teratomas verdaderos que contienen los derivados de las tres láminas germinales, y se formaron cuerpos embrioides in vitro en los cultivos en suspensión. Incluso en citohíbridos interespecíficos de este tipo, se observaron antígenos embrionarios en casos en que los compañeros somáticos en la fusión con células de teratocarcinoma tenían linfocitos o timocitos. Es digno de mención que los citohıbridos creados por la fusión de células de teratocarcinoma con fibroblastos correspondıan a fibroblastos de acuerdo con el fenotipo.

El más importante es que un hecho establecido que en-teratokartsinomno células híbridas somáticas aparecieron signos reprogramación del genoma de células diferenciadas, caracterizado por una reactivación de genes individuales o cromosoma X inactivo socio somática. Por lo tanto, los resultados de la investigación sobre las células teratokartsinomno-somática tipo tsitogibridah indican que las células híbridas a menudo conservan la pluripotencia y la reprogramación del genoma, hay señales de socio somática.

En los experimentos para obtener células híbridos intraespecíficos embrionarias mediante la fusión de esplenocitos con el animal CES ratón adulto estudiaron las características tales tsitogibridov, análisis de la segregación de los cromosomas parentales y evaluado genoma pluripotencia híbrido. Para las células híbridas interespecíficas producidas por las células de teratocarcinoma de fusión con células somáticas, generalmente caracterizada por baja segregación de cromosomas con cariotipo tetraploide o casi tetraploide. Se observó una composición cromosómica similar en el citohíbrido mediante la fusión de células sexuales primarias con linfocitos. Al mismo tiempo, las células híbridas interespecíficas obtenidas como resultado de la fusión de células de teratocarcinoma de ratón con linfocitos de visón marcaron la segregación intensiva de los cromosomas de la pareja somática.

Una etapa cualitativamente nueva en el estudio de la segregación de los cromosomas parentales en híbridos interespecíficos vino después del desarrollo del método de análisis de microsatélites utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, por lo que cada cromosoma de ratón encontraron unos pocos cientos de marcadores, lo que permite discriminar de manera fiable entre cualquier par de cromosomas homólogos en las células híbridas.

Mediante la fusión de ESK (utilizando células HM-1 deficiente en actividad gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, aislado de la cepa blastocistos de ratón 129 / 01A) con esplenocitos de ratones línea congenic DD / c no pudo recibir el conjunto de clones híbridos morfológicamente tenía similitud con hESCs. Todos los clones se aislaron en un medio selectivo en el que solo pueden crecer células con hipoxantina fosforribosiltransferasa activa. El análisis electroforético reveló la presencia de todos los clones alélica variante gipoksantinfosforiboziltransferazy característica ratones DD / c. Usando el análisis citogenético, se encontró que de los cuatro clones híbridos, tres tenían un conjunto casi diploide de cromosomas. Un clon casi tetraploide contenía dos poblaciones de células híbridas, una de las cuales era tetraploide, y la segunda, la más pequeña, diploide.

Análisis de microsatélites permitiendo discriminar cualquier par de cromosomas homólogos de ratón 129 / 01a y DD / c, en los clones híbridos con conjunto okolodiploidnym mostró que los clones se produjo en dos eliminación preferencial socio somática autosomas distinta. La mayoría de los clones autosómicos HESS2 y HESS3 tenían marcadores de línea 129 / 01a, es decir, el socio pluripotente. La excepción fue el cromosoma 1 y I: clones HESS2 y HESS3, junto con marcadores de células HM-1, un pequeño número de marcadores presentes socio somática. Estos resultados pueden reflejar la segregación incompleta de los cromosomas 1 y y socio somática y son consistentes con los datos citogenéticos que trisomía de los cromosomas que se produce en el 30-40% HESS2 y clones de células HESS3. HESS4 clon difería significativamente en composición cromosómica: muchos autosomas Este clon se originó a partir del genoma ESK (cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 y 17), pero los cromosomas 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 y 19 fueron representados por homólogos de ambos padres. La proporción cuantitativa de microsatelites que etiquetan estos cromosomas homólogos correspondía aproximadamente a 1: 1. Esto permitió a los autores a sugerir que un homólogo se deriva del genoma de la ESC y el otro - a partir de células diferenciadas. En algunos subclones del clon HESS4 observa sólo presencia simbólica de los cromosomas 18 y 19 socio somática. Los resultados indican que las células del clon HESS4, además de la segregación de cromosomas socio somática, no fue la eliminación de uno o ambos homólogos del genoma pluripotentes anteriormente cromosoma, es decir, había una segregación de dos caras de cromosomas de ambos padres - el fenómeno es bastante inusual, porque tsitogibridov segregación característico de cromosomas solamente uno de los padres.

Además, después de la 20a pasaje, todos los clones de células híbridas contienen sólo los marcadores X cromosoma de la pareja somática, es decir, en los clones fue reemplazado cromosoma X ESC en el cromosoma X de la pareja somática. Esto se confirma mediante datos de hibridación in situ utilizando una sonda marcada con FITC específica para el cromosoma X de ratón: se detectó una señal positiva solo en un cromosoma. Cabe señalar que en las primeras etapas de cultivo (hasta el pasaje 15), de acuerdo con los datos citogenéticos, en muchas células había dos cromosomas X. En consecuencia, el uso de medios selectivos hace posible manipular la composición cromosómica de células híbridas y clones selectivamente diana que llevan cromosomas individuales de la pareja somática contra el fondo del genoma ESC.

Como una característica única de la tsitogibridov genoma es la localización de genomas parentales en un solo núcleo, por supuesto, se plantea la cuestión del mantenimiento de las propiedades del genoma embrionario híbridos de células ESC-somáticas pluripotentes en las condiciones de contacto cercano con el genoma de las células diferenciadas. Morfológicamente, el citohíbrido de ESC y células somáticas se parecía a la línea parental de la ESC. La evaluación de la pluripotencia mostró que todos los clones con un conjunto casi diploide de cromosomas podían formar cuerpos embrioides en cultivos en suspensión en los que estaban presentes derivados de tres láminas germinales.

La mayoría de las células híbridas contenían el antígeno ECMA-7, un marcador característico de los embriones de ratón tempranos, y también tenían una alta actividad de fosfatasa alcalina. Los datos más convincentes sobre las altas propiedades pluripotentes de las células híbridas se obtuvieron en experimentos para obtener una serie de quimeras de inyección que implican células híbridas del clon HESS2. Un análisis de marcadores bioquímicos mostró que los descendientes de células híbridas donantes se encontraron en la mayoría de los tejidos quiméricos. Por lo tanto, las células híbridas obtenidas por fusión de ESC y células diferenciadas somáticas conservan la pluripotencia a un alto nivel, incluida la capacidad de formar quimeras cuando se insertan en la cavidad del blastocisto.

Los clones HESS2 y HESS4 difirieron significativamente en la composición de los cromosomas progenitores, pero tenían propiedades pluripotentes similares. Uno podría creer que la pluripotencia en el genoma híbrido se manifiesta como un atributo dominante, pero es posible que no todos los cromosomas del genoma embrionario estén involucrados en el proceso de mantener la pluripotencia. Si esta suposición es correcta, se puede esperar que la eliminación de algunos cromosomas de la pareja pluripotente del genoma del hibridoma no vaya acompañada de un cambio en su estado pluripotente. En este caso, un análisis de la segregación de cromosomas parentales en células híbridas embrionarias permitiría un acercamiento cercano a la identificación de cromosomas responsables de controlar la pluripotencia de las células embrionarias.

O. Serov y coautores (2001) no encontraron entre 50 descendientes obtenidos cruzando quimeras con ratones normales, como los que tendrían el genotipo de ratones 129 / 01a y portadores del cromosoma X de ratones DD. Los autores ven la razón de esto en la reducción de la pluripotencia en células híbridas bajo la influencia del genoma somático. Una explicación alternativa puede ser el efecto negativo de la trisomía en algunos autosomas y los desequilibrios en los cromosomas sexuales (se observaron XXY en las células hasta el paso 15) en células híbridas cuando pasaron la meiosis. Se sabe que las células de XXY no pueden atravesar la meiosis y formar gametos. La trisomía también puede causar una disminución en la actividad proliferativa de células híbridas, como resultado de lo cual la ventaja selectiva en el desarrollo de quimeras puede pertenecer a las células del embrión receptor. Se deduce que para evaluar adecuadamente el potencial pluripotente de las células híbridas, es necesario obtener clones híbridos con un conjunto diploide normal de cromosomas.

En experimentos Serova O. Et al (2001) demostraron por primera vez la posibilidad de reprogramación del cromosoma X en el genoma de una célula híbrida de células somáticas. Esta conclusión se desprende de los autores analizan la expresión de quimeras gen HPRT (marcador de cromosoma X): la presencia de variantes alélicas se detectó ratones HPRT DD / c en todos los tejidos analizados quimérico. Debe hacerse hincapié en que después de la introducción de células híbridas en la cavidad del blastocisto tsitogibridy caen en condiciones no selectivas y la preservación del cromosoma X en el genoma de las células híbridas significa que se ha convertido en un componente obligado de su genoma y no discrimina desde el socio cromosoma pluripotentes Y.

Resumiendo los resultados del análisis de la interacción de genomas somáticos y pluripotentes en células embrionarias híbridas, los autores concluyen que en algunos citohíbridos la pluripotencia se manifiesta como un rasgo dominante. Un genoma híbrido es capaz de reprogramar cromosomas individuales de células diferenciadas, lo que, sin embargo, no excluye la posibilidad del efecto inverso del genoma somático sobre la pluripotencia del genoma embrionario. En el cultivo de células híbridas, la inducción de la diferenciación ocurre mucho más a menudo que en la línea parental original del ESC NM-1. Se observa un efecto similar en la formación de colonias primarias: muchas colonias primarias de células híbridas embrionarias se diferencian en las primeras etapas de formación con grandes pérdidas de clones durante su selección y multiplicación.

Por lo tanto, las citohi- drinas creadas por la fusión de ESC con células somáticas, a pesar del contacto estrecho con el genoma de las células diferenciadas, conservan la pluripotencia como una propiedad única del genoma embrionario. Además, en tales células híbridas, es posible reprogramar los cromosomas individuales que se originan a partir de las células difundidas. No está claro hasta qué punto persisten las propiedades pluripotentes del genoma embrionario en las células híbridas, en particular, su capacidad para participar en la formación de la ruta embrionaria en las quimeras. Para esto, es necesario obtener células híbridas embrionarias con un cariotipo normal. En cualquier caso, las células híbridas embrionarias pluripotentes pueden ser un modelo real para la identificación genética de los cromosomas implicados en el mantenimiento de la pluripotencia o de su control como la segregación bilateral de los cromosomas parentales potencialmente ofrece tal oportunidad.

No menos atractivo es el estudio del fenómeno, que O. Serov y sus coautores (2001) definen como "memoria cromosómica". En el genoma híbrido cromosomas homólogos son dos configuraciones alternativas: homólogos somática socio una vez sometido a la diferenciación, mientras que los homólogos socio pluripotentes, este proceso apenas comienza. Por lo tanto, el mantenimiento de altas propiedades pluripotentes de células híbridas indica que "pluripotentes" homólogos de configuración ESC bastante estable en genomas híbridos, a pesar del impacto de los factores transdeystvuyuschih que emanan de la pareja somática. Las características descritas anteriormente de la reprogramación diferenciado cromosomas del genoma homóloga durante el desarrollo de las quimeras no excluyen la posibilidad de que las primeras etapas de la formación in vitro y el cultivo de tsitogibridov que conservan su estado adquirido durante la diferenciación in vivo. Según los últimos datos, al transferir las células híbridas de embriones en un medio no selectivo en el que hay un único cromosomas de eliminación socio somática intensiva, es decir, el genoma de células híbridas discrimina fácilmente homólogos después del cultivo in vitro durante 10-15 pasajes. Por lo tanto, las células híbridas embrionarias representan un modelo experimental prometedor para estudiar no solo una propiedad tan fundamental del genoma embrionario como la pluripotencia, sino también sus alternativas: la diferenciación embrionaria.

Eficacia terapéutica del trasplante de células madre embrionarias

Antes de analizar la eficacia terapéutica del trasplante de ESC y sus derivados, resumimos el material anterior. Características ESC en términos de la aplicación plena de la embriogénesis in vitro son insuficientes debido a defectos en este caso debido a la ausencia de células madre mesenquimales que se producen en el cuerpo de forma autónoma e independientemente de hESCs. La potencia genética de ESC es menor que el potencial genético del cigoto, por lo tanto, no se usa directamente para la clonación de embriones. El potencial biológico único de ESC como las únicas células en las que los programas de desarrollo se implementan en una implementación secuencial completa, encuentra aplicación en estudios sobre la función de los genes. Con la ayuda del ESC, se descifran las primeras combinaciones de señales que activan la expresión de genes tempranos y tardíos que codifican el desarrollo de tres láminas embrionarias. Preservar la pluripotencia genoma de los CES in vitro los hace herramienta única para la regeneración de reparación que puede compensar automáticamente las pérdidas de células órganos y tejidos dañados. En una encarnación ideal hipotética puede asumir que "... En el trasplante de CGP del donante en el organismo receptor se transfieren programas compacta envasados que en condiciones favorables se realizan en la construcción de nuevas tkani'7 capaz" ... Una efectiva integración en el cuerpo del receptor como morfológica, funcional y funcional ".

Naturalmente, siguiendo el desarrollo de métodos para la monodiferenciación de ESC, comenzó el estudio in vivo de la actividad funcional de células obtenidas in vitro a partir de un único clon especializado. El clon de ESO en proliferación genera poblaciones de células progenitoras en migración que son realmente capaces de integrarse activamente en las zonas de daño tisular del receptor, que se usa en la medicina regenerativa-plástica. Se ha establecido que el trasplante de neuronas Dopa en la sustancia negra reduce las manifestaciones clínicas en el hemiparkinsonianismo experimental. Los trasplantes regionales de células madre neurales de donantes reducen el grado de trastornos motores causados por traumatismos o contusiones de la médula espinal y el cerebro. Recibido y los primeros resultados positivos del trasplante de células madre en enfermedades desmielinizantes. Parecería que las potencias regeneradoras de plástico de los ESC abren posibilidades ilimitadas para usar el trasplante celular en la medicina práctica. Sin embargo, al trasplantar en zonas ectópicas, las ESC se transforman inevitablemente en tumores. Cuando se produce la inyección subcutánea de ESC en ratones inmunodeficientes, se forman teratomas. Cuando la suspensión de ESK se trasplanta debajo de la cápsula del testículo en ratones singénicos, también se forma un teratoma, que consiste en diferentes tejidos, cuyas células se derivan de los tres folíolos embrionarios. En tales teratomas, los procesos de organogénesis reducida son extremadamente raros.

Varios trabajos proporcionan información sobre los resultados positivos del trasplante de derivados tempranos de ESCO a animales con una patología experimental. Neurotransplante celular usando derivados de PGCs se desarrolla más en el experimento y los primeros ensayos clínicos de la corrección de los trastornos funcionales en el cerebro y el trauma de la médula espinal, el tratamiento de la siringomielia y la esclerosis múltiple (Repin, 2001). Con el advenimiento de la tecnología de los CES neyronogeneza in vitro, en lugar de utilizar técnicas de trasplante de tejido cerebral embrionarios derivados de neuroesferas, obtenidos a partir de cultivos de tejido neural embrionario desarrollados. Tales suspensiones de trasplante son mucho más homogéneas y contienen precursores neuronales y neuroglia comprometidos.

Además del medio de cultivo regular con ácido retinoico a una dosis de 10 ug / ml durante 6 semanas en las líneas embrionarias (teratomas) NTERA-2 -kartsinomy humano formado más del 80% de las neuronas post-mitóticas. La homogeneidad completa de la población neuronal se consigue por el flujo de clasificación marcadores inmunofenotípicos marcados de neuronas maduras que puede deshacerse de los restos teratokartsinomnyh y células inmaduras. Después del trasplante en diversas regiones del cerebro de animales de experimentación, tales neuronas no solo sobreviven, sino que también se integran en redes neuronales regionales. En los animales con modelos experimentales de defectos locales CNS neurotransplante reduce las manifestaciones clínicas de la patología humana, tales como los efectos del trauma craneoencefálico, apoplejía, enfermedades desmielinizantes, defectos de desarrollo del cerebelo hereditarias, enfermedades deposición de lípidos y polisacáridos.

Para optimizar los procesos de regeneración en enfermedades degenerativas del sistema nervioso central, se están desarrollando tecnologías para la preparación de oligodendrocitos productores de mielina de ESK. La primera etapa tradicionalmente implica la proliferación de ESC con la multiplicación del número de células necesarias para el trasplante. En la segunda etapa, se lleva a cabo la diferenciación dirigida de células en una población de precursores de oligodendrocitos productores de mielina, que está controlada por antígenos marcadores selectivos.

Algunas perspectivas se abren para los derivados de uso de los CES para desarrollar métodos para la corrección de la inmunodeficiencia causada por defectos genéticos en la maduración del timo. En estudios in knockout (trapo 1) los ratones con un defecto génico inducido - violación mecanismo de recombinación V (D) gen J loci TCR, que conducen a la pérdida de la función de los linfocitos T, trasplante de primeros derivados de las CGP en el animal timo recupera la maduración de las poblaciones normales de clones inmunes responsables de la inmunidad celular Los ensayos clínicos de trasplante de preformados en hESCs vitro para tratar la anemia hereditaria mortal en los niños.

Las objeciones a la rápida introducción del trasplante de células madre en la clínica se justifican por un número limitado de líneas de células madre embrionarias humanas estables y la necesidad de su estandarización. Para aumentar la pureza de las líneas ESC estandarizadas, así como de las células madre adultas, se sugiere un método de selección de líneas basado en el análisis genético molecular de repeticiones cortas en tándem de ADN. También es necesario probar las líneas ESC para detectar la presencia de reordenamientos cromosómicos pequeños y mutaciones genéticas, la posible posibilidad de que ocurra en condiciones de cultivo celular es suficientemente alta. La tesis sobre pruebas obligatorias de propiedades de todos los tipos de ESC y células madre pluripotentes regionales es avanzada, ya que su reproducción in vitro puede conducir a la aparición de nuevas características no inherentes a las células madre del embrión o tejidos definitivos. En particular, es permisible que el cultivo prolongado en medios de citocinas se aproxime a las líneas de ESK a células tumorales, ya que cambios similares en las formas de regulación de los ciclos celulares tienen lugar con la adquisición de la capacidad de realizar un número ilimitado de divisiones celulares. Algunos autores, sobre la base del potencial para el desarrollo de tumores, consideran el trasplante humano de derivados tempranos de células madre embrionarias como imprudencia. En su opinión, es mucho más seguro usar los descendientes comprometidos de la ESC, es decir, las líneas de los antepasados de las células diferenciadas. Sin embargo, todavía no se ha desarrollado una técnica confiable para obtener líneas celulares humanas estables que se diferencien en la dirección correcta.

Por lo tanto, en la literatura hay cada vez más datos sobre el efecto terapéutico positivo del trasplante de derivados de células madre embrionarias humanas. Sin embargo, muchas de estas obras están sujetas a revisión y crítica. Algunos investigadores creen que los resultados de los primeros ensayos clínicos son de naturaleza preliminar y sugieren solo que las células madre pueden tener un efecto beneficioso en el curso clínico de una enfermedad. Por lo tanto, es necesario obtener datos sobre los resultados a largo plazo del trasplante celular. Como argumento, se dan las etapas del desarrollo de la neurotransplantología clínica. En efecto, en la literatura, inicialmente dominado por la publicación de la alta eficiencia de los fragmentos de trasplantes cerebrales de embriones en la enfermedad de Parkinson, pero luego comenzaron a aparecer informes negando la eficacia terapéutica de tejido neural embrionario o fetal trasplantado en los cerebros de pacientes.

Llevada a cabo los primeros ensayos clínicos que evaluaron la seguridad de neuroblast trasplante - derivados de PGCs NTERA-2 teratocarcinoma, células inmaduras que proliferan en cultivo se sometieron a almacenamiento 100 masa celular millonésima. Algunas de las células así obtenidas se utilizaron para caracterizar el fenotipo y determinar las impurezas celulares, así como para detectar posibles contaminaciones por virus y bacterias. Desde el medio de cultivo se retiró LIF y la capa alimentadora de células estromales y condiciones fetales creados para la diferenciación dirigida de hESCs en neuroblastos con una combinación de citoquinas y factores de crecimiento. Luego, los neuroblastos se purificaron a partir de células de teratocarcinoma inmaduras en un clasificador de jaulas de flujo. Después de la segunda purificación y caracterización del fenotipo de los neuroblastos células trasplantadas (10-12 millones) suspensión con una jeringa y microcánulas estereotaxia especial y bajo el control de CT inyecta en el núcleo basal del cerebro de los pacientes (el séptimo mes después del accidente cerebrovascular hemorrágico). El cribado posterior a un trasplante de un año de las consecuencias del trasplante neuronal en la zona de accidente cerebrovascular no mostró efectos secundarios ni efectos indeseables. La mitad de los pacientes experimentó una mejora en la función motora en el período de 6 a 12 meses después del trasplante. Cambios clínicos positivos fueron acompañados por un aumento en la zona de carrera de suministro de sangre después del trasplante de células: aumento de absorción media de la 2-desoxiglucosa marcada con fluorescencia, según la tomografía por emisión de positrones alcanzó 18%, y en algunos pacientes - 35%.

Sin embargo, el Instituto Nacional de Salud de EE. UU. Llevó a cabo un estudio independiente de la eficacia clínica del neurotrasplante en pacientes con Parkinsonismo. Los pacientes del primer grupo fueron trasplantados con tejido nervioso embrionario que produce dopamina, mientras que el segundo grupo de pacientes se sometió a una operación falsa. Los resultados indican una eficacia clínica nula de dicho neurotrasplante, a pesar del hecho de que las neuronas embrionarias productoras de dopamina sobrevivieron en el cerebro de los receptores. Por otra parte, después de 2 años después del trasplante de tejido neural fetal en el 15% de los pacientes desarrollaron discinesia persistente, que está ausente en los pacientes del grupo placebo (Las células madre: el progreso científico y futuras líneas de investigación Nat Inst, EE.UU. De Salud ...). Las observaciones del mayor desarrollo de la enfermedad en estos pacientes continúan.

Algunos autores atribuyen la literatura contradictoria sobre la evaluación de los datos de eficacia neurotransplante clínicos con un enfoque diferente para la selección de los grupos de pacientes, inadecuada elección de los métodos objetivos para evaluar su condición y, lo más importante, diferentes términos del desarrollo del tejido nervioso fetal y en diferentes partes del cerebro a partir del cual se produce la tela en diferentes tamaños trasplante y características metódicas de la cirugía.

Cabe señalar que los intentos de dirigir el trasplante de células madre embrionarias pluripotentes en la región estriatal del cerebro de ratas con gemiparkinsonizmom cuerpo experimental acompañada proliferación ESC y su diferenciación en neuronas dopaminérgicas. Hay que suponer que las neuronas recién formadas construyeron efectivamente en la red neuronal como los CES después del trasplante, se observó la corrección de anomalías de comportamiento y asimetría motor en la prueba de apomorfina. Al mismo tiempo, algunos de los animales murieron debido a la transformación de ESK trasplantado en el tumor cerebral.

Los expertos de la Academia Nacional y medicina de Estados Unidos, los especialistas de los Institutos Nacionales de Salud creen que el potencial clínico de hESCs merece una seria atención, sin embargo, insisten en la necesidad de un estudio detallado de sus propiedades, la probabilidad de complicaciones y efectos a largo plazo en experimentos con modelos biológicos adecuados de enfermedades humanas (células madre y la futura medicina regenerativa National Academy Press, Stem cell and the future research directions., Nat. Inst, of Health USA).

Desde este punto de vista, es importante que el análisis histológico comparativo de teratoma experimentales obtenidos por el trasplante en PGCs en suspensión espesa de testículo con teratomas que se han desarrollado debido a trasplante de embrión temprano, que incluían también presente ESC mostró que ESK independientemente de su origen o la interacción con por esas u otras células circundantes de la misma manera se dan cuenta de sus potencias tumorigénicas. Se demostrado que tales teratomas tienen un origen clonal, como de un CES tumorales puede ocurrir, que consiste en los derivados de las tres capas germinales (.Rega, 2001). Es de destacar que cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes PGCs con cariotipo normal y teratomas formadas consisten en una variedad de tipos de células somáticas diferenciadas clonados. Estos datos experimentales son la prueba perfecta del origen clonal del teratom. Desde la perspectiva de la biología del desarrollo, sugieren que no es múltiplo de células progenitoras comprometidas y la identidad de células madre pluripotentes es la fuente de los derivados diferenciadas de las tres capas germinales, componentes teratoma. Sin embargo, en los resultados prácticos de trasplante de células de estos estudios son, si no es prohibitivo, a continuación, una señal de advertencia de peligro potencial, ya ESC inoculación o células germinales primordiales en diferentes tejidos de los ratones inmunodeficientes adultos provoca inevitablemente el desarrollo de los tumores de las células madre trasplantadas. La degeneración neoplásica trasplantado ectópica ESC acompañado de la aparición de poblaciones de células diferenciadas satélite - por parte diferenciación es, sin duda los CES y clones progenitoras líneas dedicadas. Curiosamente, cuando se trasplanta ESC a los músculos esqueléticos junto a las células de teratocarcinoma, las neuronas se forman con mayor frecuencia. Sin embargo, en PGCs administran Mace huevo o blastocisto acompañados por la plena integración en las células germinales sin la formación de las células neoplásicas. En este caso, las ESC se integran virtualmente en todos los órganos y tejidos del embrión, incluido el rudimento sexual. Tales animales allofennye se prepararon primero sometiendo la célula teratocarcinoma 129 en las primeras etapas de embriones a 8-100 células. En allofennyh poblaciones ratones geterogenomnyh derivados de células CGP de donante se introducen en la médula ósea, intestino, piel, hígado y los genitales, que le permite crear en el experimento incluso entre especies quimeras de células. Cuanto menor sea el tiempo de embrión temprano, mayor será el porcentaje de quimerización celular, la más alta quimerización grado observado en el sistema hematopoyético, de la piel, el sistema nervioso, el hígado y el intestino delgado allofennogo embrión. En el organismo adulto la quimerización susceptibles tejido protegido de la exposición al sistema inmunitario de las barreras gistogematicalkie receptor: células germinales de trasplante primordial en el parénquima testicular acompañado por la inserción de células madre del donante en la capa germenativny tejido receptor. Sin embargo, no se produce ESC trasplante en una formación de blastocisto genitales primordios quiméricos con células germinales primordiales donantes generación. ESC pluripotencia al crear condiciones especiales y puede ser utilizado para la clonación: ratones de trasplante ESC 8-16 de células de embrión de ratón, la mitosis celular en la que tsitokalazinom bloqueada, contribuye a la embriogénesis normal con el desarrollo de las CGP de donante del embrión.

En consecuencia, una alternativa es el trasplante de alogénico clonación terapéutica ESC basado en el trasplante nuclear de células somáticas en un oocito enucleado para crear una masa celular interna de blastocistos a partir de los cuales se asigna entonces línea de CGP de donante genéticamente idénticos núcleo somático. Técnicamente, esta idea es factible, ya que la posibilidad de la creación de líneas de células madre a partir de blastocistos obtenidos después del trasplante de núcleos somáticos en la célula huevo enucleado demostrado repetidamente en experimentos con animales de laboratorio (Nagy, 1990; Munsie, 2000). En particular, en ratones homocigotos para la mutación rag2, los fibroblastos obtenidos mediante el cultivo de células se utilizaron tejidos subepidérmicas como núcleos donantes se trasplantan en oocitos enucleados. Después de la activación, los ovocitos "cigoto" cultivan hasta la formación de blastocisto, a partir de la masa celular interna es PGCs aisladas y pasarlos en una línea para las células gen nullizigotnyh mutantes (rag2 ~ / ~). Por recombinación homóloga en tales CES, se corrigió la mutación de un gen alélico. En la primera serie de experimentos de hESCs gen recombinante recuperado se prepararon cuerpos embrioides, transfectaron células del mismo con un retrovirus recombinante (HoxB4i / GFP) y después de la propagación en ratones inyectados vena rag2 ~ / ~. En la segunda serie, los blastómeros tetraploides se agregaron con ESC genéticamente modificados y se trasplantaron a sus receptoras femeninas. Los ratones inmunocompetentes nacidos sirvieron como donantes de médula ósea para el trasplante a ratones mutantes rag2 ~ / ~. En ambas series, el resultado fue positivo: después de 3-4 semanas, todos los ratones normales y las células linfoides, capaces de producir inmunoglobulinas, se encontraron en todos los ratones. Por lo tanto, el trasplante en los núcleos de ovocitos de las células somáticas puede ser utilizado no sólo para producir líneas de células madre, sino también para tsitogenoterapii - Corrección de anomalías hereditarias utilizando ESC como un vector para el transporte de la corrección de la información genética. Pero en esta dirección del trasplante de células, además de los problemas bioéticos, existen limitaciones. No está claro cómo la caja fuerte el trasplante de células sería terapéuticamente clonó con un genotipo idéntico al genotipo de un paciente en particular, debido a que tales células se pueden introducir mutaciones que crean una predisposición a ciertas enfermedades. óvulos humanos normales siguen siendo objeto inaccesible, mientras que incluso cuando el trasplante de núcleos somáticos en ovocito enucleado animales solamente 15-25% de ingeniería "cigoto" se desarrollan hasta la fase de blastocisto. No se determina cuánto blastocisto se requiere para obtener una sola línea de ESC clonados pluripotentes. Cabe señalar y un alto nivel de costos financieros asociados con la complejidad de la metodología de clonación terapéutica.

En conclusión, en el genoma de la pluripotencia ESC hypomethylated ADN se combina con la actividad de la telomerasa alta y la fase ^ ciclo celular C corto, lo que garantiza la multiplicación intensiva y potencialmente infinita, durante el cual las PGCs conservan los cromosomas diploides y ajuste "menores" de las características fenotípicas. El crecimiento clonal de PGCs en cultivo no se opone a ellos diferenciarse en cualquier célula especializada del organismo a una proliferación de la línea de parada y la adición de señales reguladoras apropiadas. Diferenciación restricción de hESCs en línea en células somáticas vitro se realiza sin la participación de la mesénquima, sin pasar por Nohteyaov, es la organogénesis y sin la formación del embrión. La administración ectópica de ESC in vivo conduce inevitablemente a la formación de teratocarcinomas. Trasplante de ESC en un blastocisto o embrión temprano acompañado de su integración con los tejidos del embrión y sus órganos quimerización estables.

Tecnologías regenerativas y plástico basado en el trasplante de células es el punto de intersección de los intereses de los miembros de la biología celular, biología del desarrollo, la genética experimental, inmunología, neurología, cardiología, hematología, y muchos otros campos de la medicina experimental y práctico. Los resultados experimentales más importantes demuestran la posibilidad de reprogramación de las células madre con la dirección del cambio de sus propiedades, lo que abre perspectivas para el control de procesos de citodiferenciación con factores de crecimiento - para la regeneración del miocardio, la restauración de las lesiones del SNC y normalización de la función del aparato de los islotes del páncreas. Sin embargo, los derivados generalizadas de trasplante introducción ESC en la práctica médica es necesario investigar las propiedades de las células madre humanas con más detalle y otros experimentos con PGCs en modelos experimentales de enfermedades.

Las cuestiones de bioética y el problema del rechazo del trasplante de células alogénicas podrían resolver la plasticidad observada del genoma de las células madre adultas regionales. Sin embargo, la información inicial es que cuando el trasplante de hígado células hematopoyéticas autólogas aisladas y caracterizadas a fondo, de los cuales hay nuevos hepatocitos, incorporando en los lóbulos hepáticos, ahora están siendo revisada y criticada. Sin embargo, los datos publicados que el trasplante de células madre neurales en el timo es la formación de nuevos brotes de T de donante y los linfocitos B, y el trasplante de células madre neurales del cerebro en la médula ósea conduce a la formación de hematopoyéticas germinales sostenida mieloide donante y la eritropoyesis . En consecuencia, en órganos adultos se puede conservar las células madre pluripotentes capaces de reprogramación genoma de ESC a la capacidad.

El embrión humano sigue siendo la fuente de recepción de la ESC para fines médicos, lo que predetermina la inevitabilidad de una nueva intersección de problemas morales, éticos, morales, legales y religiosos en el momento del nacimiento de la vida humana. El descubrimiento de las ESC dio un fuerte impulso a la reanudación de las duras discusiones sobre dónde se encuentra la línea entre las células vivas y la materia, la sustancia y la personalidad. Al mismo tiempo, no existen normas universales, reglas y leyes con respecto al uso de ESC en medicina, a pesar de los repetidos intentos de crearlas y aceptarlas. Cada estado dentro de su legislación resuelve este problema por sí mismo. Por su parte, los médicos de todo el mundo continúan intentando desarrollar una medicina plástica regenerativa más allá de tales discusiones, principalmente mediante el uso de células madre no embrionarias y las reservas de células madre de un organismo adulto.

Parte de la historia del aislamiento de células madre embrionarias

Se aislaron Terato- células (embriones) de -kartsinomnye aparición espontánea testicular cepa teratomas ratón 129 células / ter-Sv, espontáneas de ovario líneas teratomas ratón Lt / Sv, y de teratomas, se trasplantaron ektopichno fuente o tejido embrionario. Entre así obtenidos terato- líneas estables de ratón (embriones) -kartsinomnyh algunas células son pluripotentes, otros fueron sometidas a diferenciación sólo en las células de un tipo particular, y algunos han sido generalmente incapaces de citodiferenciación.

En ese momento, la atención se centró la investigación mostró que una posible terato- retorno (embrión) -kartsinomnyh células de fenotipo normal después de su introducción en el tejido embrión en desarrollo, así como el trabajo para crear in vitro terato- genéticamente modificado (embrión) -kartsinomnyh células, con la ayuda de los cuales se obtuvieron ratones mutantes para la modelización biológica de la patología hereditaria humana.

Para aislar terato- líneas (embriones) se ha utilizado en el aire acondicionado de cultivo en suspensión de células -kartsinomnyh. En terato- cultivo (embrión) -kartsinomnye células, como los CES, crecer para formar cuerpos embrioides y requieren para ser traducido en una línea de disociación de unión mantenimiento de la pluripotencia en una capa alimentadora de fibroblastos de embriones o el cultivo de suspensión en medio condicionado. Terato- células pluripotentes (embriones) - líneas de carcinoma grande, esféricas, tienen una alta actividad de la fosfatasa alcalina, forman agregados y son capaces de diferenciación multidireccional. Cuando se introduce en un blastocisto se agregan con mórulas, resultando en la formación de embriones quiméricos, en los diferentes órganos y tejidos que los derivados se encuentran terato- (embriones) células -kartsinomnyh. Sin embargo, la gran mayoría de tales embriones quiméricos morir en el útero, y en los órganos sobrevivientes quimeras células extrañas recién nacidos y rara vez se detecta con una baja densidad. Al mismo tiempo, la incidencia de tumores (fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y otros tipos de inflamación maligno y Páncreas adenoma) aumenta bruscamente, y la degeneración neoplásica a menudo se produce incluso en el útero los embriones quiméricos.

La mayoría de las células de terato-embrio-carcinoma en el microambiente de las células embrionarias normales casi naturalmente adquieren características neoplásicas malignas. Se cree que la malignidad irreversible se debe a la activación de protooncogenes en el proceso de reordenamientos estructurales. Una excepción son las líneas celulares embriokartsinomnoy SST3, teratoma derivada de testículo murino (línea 129 / Sv-ter), que presentan una alta capacidad de integrarse en el tejido y órganos del feto sin la posterior formación de tumores en ratones quiméricos. Los derivados de las líneas celulares terato-embrio-carcinoma en ratones quimera prácticamente no participan en la formación de los gonocitos primarios. Obviamente, se conecta con una alta frecuencia de aberraciones cromosómicas comunes a la mayoría terato- (embrión) líneas -kartsinomnyh en el que células observadas como aneuploidía o anomalía cromosómica.

En el laboratorio, se obtuvieron varias líneas estables de terato-embrio-carcinomas humanos, caracterizados por pluripotencia, alta actividad proliferativa y la capacidad de diferenciarse con crecimiento en cultivos. En particular, la línea de terato-embrio-carcinoma células humanas NTERA-2 se utilizó para estudiar los mecanismos de citodiferenciación neural. Después del trasplante de células de esta línea en la región subventricular del prosencéfalo de ratas recién nacidas, se observó su migración y neuronogénesis. Ha habido incluso los intentos para trasplantar terato- neuronal obtenido mediante el cultivo de células (embrión) línea -kartsinomnoy NTERA-2, a los pacientes con accidentes cerebrovasculares, que, según los autores, que conducen a una mejoría clínica de la enfermedad. En este caso, los casos de malignidad de las células trasplantadas de la línea terato-embrio-carcinoma NTERA-2 en pacientes con accidente cerebrovascular no se observaron.

La primera línea de células madre embrionarias pluripotentes no diferenciadas de los ratones a principios de los 80-s del siglo pasado consiguió Evans y Martin, seleccionándolos de la masa celular interna del blastocisto - embryoblast. Las líneas ESC aisladas durante mucho tiempo preservaron la pluripotencia y la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células bajo la influencia de factores de un medio de cultivo especial.

El término "células madre embrionarias pluripotentes" pertenece Leroy Stevens que la investigación de impacto el alquitrán del tabaco en la frecuencia de desarrollo de tumores llamó la atención a la aparición de teratocarcinoma espontánea testicular de lineal (129 / v) de los ratones del grupo de control. Células de teratocarcinoma de testículo se caracterizan por una alta tasa de proliferación, y en presencia de líquido que queda en la cavidad abdominal con la formación de diferenciación espontánea de las neuronas, queratinocitos, condrocitos, los cardiomiocitos, así como fragmentos de pelo y de los huesos, pero sin ninguna indicación de un cytoarchitectonics ordenados tejido apropiado. Cuando la plantación en cultivo celular teratocarcinoma crecido sin unir a los clones pluripotentes sustrato y cuerpos embrioides formados se inactivan después y se sometieron a desordenada fisión espontánea diferenciarse en neuronas, glía, células del músculo y cardiomiocitos. Stevens encontró que teratocarcinoma de ratón 129 / v contiene menos de 1% de células capaces de diferenciarse en una variedad de línea somática especializada, y la propia diferenciación depende de factores que las afectan (líquido peritoneal composición, los productos añadidos al cultivo de células o tejidos maduros). Leroy Stevenson supuesto acerca de la presencia entre células de teratocarcinoma se confirmó células germinales sexual progenitoras embrionarias: la suspensión embryoblast células embriones de preimplantación en los tejidos de ratón adulto teratocarcinoma formado, y separado de ellos líneas celulares puros después de la administración intraperitoneal a los animales receptores se había diferenciado en neuronas, cardiomiocitos y otros kletki somática derivados de las tres capas germinales. En los experimentos en el trasplante vivo ESK (obtenido de embryoblast pero no trofoblasto) en embriones de ratón en diferentes líneas etapas 8-32 blastómero finalizado el nacimiento del animal quimérico (sin formación de tumores) en órganos que detecta tejido brotes donante. El quimerismo se observó incluso en la línea de células sexuales.

Células germinales progenitoras primarias aisladas a partir de embriones de ratón de germen de sexo, morfología, fenotipo características inmunológicas y funcionales consistentes con hESCs derivadas de teratocarcinoma Stevenson y embrioblasto. En quimeras nacidos después de la administración de hESCs en un blastocisto, allofenny la morfogénesis de órganos de donantes caracteriza alterna mosaico y el receptor estructural y unidades funcionales del hígado, pulmón y riñón. En varios casos, se observó la formación de criptas intestinales o lóbulos del hígado que consisten simultáneamente en las células receptoras y donantes. Sin embargo, siempre la realización de la morfogénesis se produjo de acuerdo con el programa genético de la especie a la que pertenecía el receptor, y el quimerismo se limitó únicamente al nivel celular.

Entonces, se encontró que la proliferación de hESCs sin citodiferenciación en un alimentador de células mesenquimales capa derivado (fibroblastos fetales) se produce en presencia de LIF de unión en medios nutrientes selectivos que proporcionan selectivamente sólo la supervivencia de las células madre y progenitoras, mientras que la gran mayoría de los elementos celulares especializados muere. Con la ayuda de estas técnicas en 1998 por James Thomson se asignaron cinco líneas inmortalizadas de células madre embrionarias a partir de la masa celular interna del blastocisto una persona. Ese mismo año, John Gerhart ha desarrollado un método para aislar las líneas ESC inmortales de hojaldre sexual de embriones humanos, cuatro, cinco semanas. Debido a sus propiedades únicas, sólo dos años después embrionario las células madre y las células del tejido definitiva ha comenzado a utilizarse en la práctica de la medicina regenerativa y la terapia génica se derivan.