Células madre embrionarias

El descubrimiento de las células madre embrionarias no fue casual, sino que surgió en el terreno preparado de la investigación científica en el campo de la biología del desarrollo. El término "célula madre" fue introducido en la medicina en 1908, en el congreso de la sociedad hematológica de Berlín, por Alexander Maximov, en relación con las células hematopoyéticas. Mucho antes del aislamiento y la producción de líneas estables de células madre embrionarias pluripotentes, las células madre de teratocarcinoma (células madre embrionarias) se utilizaban en estudios de los procesos de desarrollo temprano, con ayuda de los cuales se estudiaron mecanismos desconocidos de la embriogénesis, incluyendo la secuencia de expresión de genes tempranos y los productos proteicos de su actividad.

Pero ¿se pierde irremediablemente la totipotencia del genoma humano en el proceso evolutivo? No, y la embriogénesis es prueba de ello. De ser así, ¿cuándo, en principio, se materializará la segunda vía de desarrollo evolutivo? Probablemente, cuando el hombre entre en el espacio, donde las condiciones ambientales se mantendrán relativamente constantes durante un tiempo suficientemente largo. La pérdida de tejido óseo (desmineralización de los huesos en estado de ingravidez), que se remodela y regenera muy lentamente, puede considerarse el primer paso en el proceso de adaptación del ser humano, como especie, a la existencia en condiciones espaciales. Sin embargo, el precio de la segunda vía de desarrollo evolutivo será diferente: el precio del retorno de la totipotencia y la plasticidad absoluta a todas las células será la esterilidad. Así pues, en este mundo de "camaleones evolutivos", tendremos que reproducirnos sin meiosis, mediante gemación. Pero viviremos mucho tiempo. La inmortalidad de la telomerasa es la inmortalidad de una ameba. En un organismo multicelular, las células madre son el sustrato de la longevidad cuantitativa y cualitativa.

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Fuentes de células madre embrionarias

Hoy en día, las fuentes de células madre embrionarias para la investigación de laboratorio son las líneas de teratocarcinoma de ratón (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) y el teratocarcinoma humano (clon NTERA-2, TERA-2, H-9), así como las líneas de ESC Trauneon. Sin embargo, la disponibilidad de un pasaporte celular detallado que indique el fenotipo inmunitario, los resultados del análisis cromosómico, los perfiles de expresión de ARNm, los receptores expuestos y las proteínas de señalización intracelular no compensa las deficiencias significativas de las líneas de ESC de teratocarcinoma: pérdida rápida de totipotencia e imposibilidad de usarlas en ensayos clínicos, mientras que la diferenciación mixta en cultivo hace muy difícil aislar una línea especializada pura de una población celular heterogénea. Por lo tanto, la fuente de las líneas ESC creadas para fines clínicos suele ser la masa celular interna del blastocisto, blastómeros individuales de embriones en etapa de 8 células, células de mórula de etapas posteriores, así como células germinales primordiales.

Cabe destacar que las células de teratocarcinoma, si bien poseen pluripotencia, se caracterizan por un potencial pluripotente significativamente menor en comparación con las células madre embrionarias (CME). Su integración con células embrionarias rara vez conduce a la formación de quimeras, que, además, nunca forman gametos con el genotipo de las células de teratocarcinoma. Se cree que esto se debe a la frecuente aparición de anomalías cromosómicas durante el cultivo de células de teratocarcinoma: pérdida del cromosoma Y, diversas trisomías, deleciones o translocaciones.

Se han realizado repetidos intentos para aislar una línea de células madre embrionarias humanas (CME), pero esta tarea no se ha resuelto debido a la dificultad para acceder a los blastocistos humanos normales. Además, la frecuencia de anomalías cromosómicas en humanos es mayor que en la embriogénesis animal. La gran mayoría de los embriones humanos tempranos obtenidos tras la fecundación in vitro presentan mosaicismo cromosómico caótico y, a menudo, presentan aberraciones numéricas y estructurales. Incluso más tarde, en la etapa de blastocisto, solo entre el 20 % y el 25 % de los embriones humanos consisten en células con un cariotipo normal. Era prácticamente imposible utilizar estos embriones para crear CME, ya que los cigotos solían cultivarse hasta la etapa de dos o cuatro blastómeros y luego trasplantarse al útero. Solo recientemente se ha desarrollado una técnica fiable para cultivar óvulos humanos fecundados hasta la etapa de blastocisto. La introducción de esta técnica en la práctica de la fecundación in vitro no solo ha aumentado la frecuencia de éxito en la implantación, sino que también ha facilitado el acceso a los blastocistos normales.

Otra fuente de células madre pluripotentes son las células germinales primordiales, las cuales, a diferencia de las poblaciones progenitoras más avanzadas del epitelio germinal, no tienen beta-integrina en su superficie, pero expresan alta actividad de fosfatasa alcalina. Cabe señalar que las poblaciones de células madre que se formaron a partir de células germinales primordiales han sido estudiadas experimentalmente desde la década de 1980. En ese momento, se desarrolló una técnica para aislar células germinales primordiales del rudimento de la gónada del embrión de ratón. Los primeros resultados fallidos del cultivo de células germinales primordiales in vitro sugirieron la inutilidad de estos intentos, ya que las células, aunque sobrevivieron, no proliferaron y murieron dentro del primer día. Posteriormente se estableció que las células germinales primordiales del ratón se reproducen in vitro solo en presencia de factores de crecimiento polipeptídicos específicos solubles y unidos a la membrana en el medio de cultivo. Los resultados de numerosos estudios han demostrado que, para la supervivencia y proliferación de las células germinales primarias, es necesaria la presencia en el medio de cultivo no solo de LIF, sino también de factores Steel (SIF) solubles y unidos a la membrana. Estos péptidos son producidos por células somáticas de embriones homocigotos para la mutación Steel, y uno de ellos es un ligando del protooncogén cKit.

Las células germinales primarias de mamíferos y humanos tienen un origen extragonadal y son la fuente del desarrollo clonal de la línea celular germinal. El origen de la línea celular germinal primordial, así como todos los tejidos embrionarios y el mesodermo extraembrionario, es el epiblasto (ectodermo primario) de los embriones tempranos, que tiene una organización estructural en mosaico. Usando el método de extirpación microquirúrgica de varias partes del embrión temprano, se estableció una zona de localización en el epiblasto del clon de precursores comprometidos de células germinales primordiales. Usando rodamina dextrano, que se usó como marcador celular, se estableció que los precursores de células germinales primordiales se localizan en la región proximal del epiblasto, cerca del ectodermo extraembrionario. La línea celular germinal primordial surge de un clon de 45 células, cuya asignación ocurre al comienzo mismo de la gastrulación. Luego, el clon se segrega y, durante la gastrulación, las células germinales primarias ingresan al mesodermo extraembrionario y se encuentran en la base del rudimento alantoides, detrás de la línea primaria. Desde allí, las células germinales primarias migran hacia la parte ventral del endodermo del intestino posterior y luego se mueven activamente a lo largo del mesenterio, poblando las crestas genitales al final de la migración. Durante la migración, así como en los primeros 2-3 días de localización en el rudimento gonadal, las células germinales primarias proliferan activamente y experimentan ocho ciclos replicativos. Si al comienzo de la migración hay alrededor de 50 células germinales primarias, entonces, en las crestas genitales de embriones de ratón de doce días de desarrollo, el número de células germinales primarias supera las 25,000.

La similitud funcional entre las células madre embrionarias (CME) y las células germinales primordiales se evidencia por la completa integración de estas últimas en el blastocisto, con la sustitución de la masa celular interna y el posterior desarrollo completo del embrión, cuyos tejidos están compuestos únicamente por los descendientes de las células germinales primordiales. En otras propiedades, las células germinales primordiales de ratón también resultaron ser idénticas a las CME, lo que demuestra la capacidad de diferenciarse en diversas direcciones, formar cuerpos embrionarios in vitro y formar teratomas in vivo al administrarse por vía subcutánea a ratones inmunodeficientes, similares a los teratomas testiculares espontáneos en ratones 129/ter.

Se encontró que cuando se añaden al medio LIF, SIF unido a la membrana y soluble, células germinales primarias aisladas de embriones de ratón de 8 días de edad sobreviven y se reproducen en el cultivo durante 4 días, pero luego mueren. Además, el período en que se observa la muerte de células germinales primarias en el cultivo coincide con la etapa de desarrollo de los embriones de ratón (12,5-13,5 días) cuando las células germinales primarias femeninas entran en meiosis en los rudimentos de las gónadas, y las divisiones mitóticas se bloquean en las células germinales primarias masculinas. Sin embargo, si no solo se añaden al medio los factores de crecimiento LIF y SIF, sino también FGF2, las células germinales primarias continúan proliferando y se forman colonias de células capaces de multiplicarse incluso después de la eliminación de los factores de crecimiento (SIF y FGF) del medio en los subcultivos. Dichas células pueden cultivarse durante un largo tiempo en un sustrato de fibroblastos embrionarios sin añadir el factor de crecimiento soluble LIF. Se propuso llamar a estas líneas celulares estables obtenidas de células germinales primordiales células germinales embrionarias. Este término no es del todo acertado, ya que es imposible obtener células germinales embrionarias capaces de realizar etapas posteriores de ovogénesis o espermatogénesis al cultivar células EG. Esto se debe a que las líneas celulares EG, si bien se originan a partir de células germinales primordiales, al adquirir las propiedades de las células madre pluripotentes embrionarias en cultivo, pierden la capacidad de vincularse con linajes germinales. En otras palabras, las células germinales primordiales, al cultivarse, pierden las propiedades de los precursores de gametos y se transforman en células pluripotentes similares a las células madre embrionarias.

Se ha observado que los teratomas no surgen cuando se introducen células EG en ratones inmunodeficientes. Se supone que la pérdida de la capacidad de las células EG humanas para generar teratomas se debe a que estas líneas no se crearon directamente a partir de células germinales primarias cultivadas, sino que se obtuvieron de células aisladas de cuerpos embrionarios. Por lo tanto, es posible que sean descendientes de células pluripotentes, pero ya comprometidas.

Cabe destacar que existen diferencias fundamentales entre las células EG y las células germinales primordiales. Estas últimas no permiten la obtención de embriones quiméricos de ratón, lo que indica la incapacidad de las células germinales primordiales para integrarse en la masa celular interna o trofectodermo. Las características de la población de células germinales primordiales son más similares a las de las líneas comprometidas de células somáticas de embriones posteriores, cuya introducción en el blastocisto tampoco conduce a la formación de embriones quiméricos.

La modificación de la técnica de cultivo de cuerpos embrionarios obtenidos por agregación de células EG permitió obtener otra población de células pluripotentes, denominadas "células derivadas de cuerpos embrionarios" (células EBD), mediante selección en medios selectivos. La capacidad de las células EBD para proliferar en cultivo durante un largo periodo de tiempo permitió crear líneas celulares estables de células comprometidas. Se obtuvieron clones de células que expresaban una amplia gama de marcadores de ARNm y proteínas de células especializadas. Este enfoque demostró finalmente que las células germinales primarias humanas son pluripotentes y se diferencian in vitro en diferentes tipos celulares: neuronas, neuroglia, endotelio vascular, células hematopoyéticas, células musculares y endodérmicas.

Fuentes alternativas de células madre embrionarias

Una fuente alternativa de líneas de células madre embrionarias humanas podría ser las células híbridas. La implantación en el útero de vacas pseudopreñadas de una construcción heterogénea obtenida mediante fusión por electroporación de células somáticas de un feto humano con un óvulo de vaca, previamente extirpado del pronúcleo, permite obtener una masa celular interna a partir de un embrión artificial en etapas de desarrollo preimplantacional. Para ello, en la primera etapa se obtiene un blastocisto de un óvulo de vaca con un núcleo celular humano trasplantado.

En la segunda etapa, se aísla un embrioblasto del blastocisto y, a partir de él, se aíslan células madre embrionarias (CME) mediante el método de Thomson. Cabe destacar que los mejores resultados en el aislamiento de líneas de CME mediante este método se obtuvieron utilizando núcleos de células foliculares o células germinales primarias que permanecen en el cuerpo humano en estado de hibernación. Esto se debe a que los núcleos de las células humanas trasplantadas a un óvulo de vaca deben tener telómeros no acortados y una alta actividad telomerasa, lo que ayuda a evitar el envejecimiento prematuro de los clones de CME obtenidos de un óvulo híbrido (Repin, 2001). Se sabe que las proteínas marcadoras intracelulares más importantes de las CME son Oct3, Oct4, Tcf y Groucho, que pertenecen a las denominadas proteínas silenciadoras de la cromatina. Los silenciadores proporcionan un empaquetamiento particularmente compacto de la heterocromatina, lo que previene la formación de bucles de eucromatina. El empaquetamiento de la cromatina mediado por estas proteínas se correlaciona con la totipotencia del genoma de las CME. Hasta la fecha, se ha establecido que los ovocitos maduros bovinos y humanos son el único tipo de células especializadas que contienen altas concentraciones de proteínas silenciadoras en el citoplasma. Con base en esto, se desarrolló un método para obtener células madre embrionarias híbridas (CME) mediante la transferencia de núcleos de células somáticas a ovocitos bovinos enucleados. Estudios preliminares in vitro han demostrado que el citoplasma de los ovocitos bovinos restaura la totipotencia del genoma de los núcleos de células somáticas humanas después de 12 a 24 horas de cultivo.

De particular interés son los datos sobre las peculiaridades del desarrollo preimplantacional de embriones humanos, que indican una sustitución de células totipotentes por una población de células pluripotentes más tardía que en ratones. Un estudio de transformaciones celulares mostró que las células trofoblásticas también surgen de las células de la masa celular interna de los blastocistos humanos, además de las células madre embrionarias (CME), lo que indica su potencia total.

Se sabe que en la etapa de blastocisto surgen dos poblaciones celulares con diferente compromiso. Una de ellas forma la capa externa del blastocisto: el trofectodermo, cuyos derivados son las células del trofoblasto y otros componentes embrionarios de la placenta. La segunda población de células se agrupa en una masa densa en contacto con la superficie interna del trofectodermo. Los derivados de la población de células de la masa celular interna son todos los tejidos y rudimentos de los órganos del embrión. En la etapa del blastocisto tardío, el endodermo extraembrionario se forma a partir de la masa celular interna y se forma el epiblasto (ectodermo primario). En este caso, las células del epiblasto conservan la pluripotencia, mientras que la capacidad de diferenciar las células del endodermo extraembrionario es limitada.

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Obtención de células madre embrionarias humanas

Hasta hace poco, se creía imposible obtener células madre embrionarias (CME) del trofoblasto. Sin embargo, una línea de células madre diploides del trofectodermo, aislada de un blastocisto, prolifera y se transforma en células madre en un medio que contiene FGF2 y heparina en lugar de LIF. Si se elimina el FGF2 del medio, las células del trofectodermo dejan de multiplicarse, comienza la endorreduplicación cromosómica y los elementos celulares del trofectodermo se transforman gradualmente en células trofoblásticas gigantes. Probablemente, el LIF no estimula la proliferación de células del trofectodermo debido a que el FGF2 desencadena un mecanismo de transseñalización diferente, ya que el FGF2, al unirse al receptor plasmático (FGFR2), activa las quinasas MAP en el citoplasma: ERK1 y ERK2. En consecuencia, cuando una vía de señalización (LIF - gpl30 - JAK quinasa - STAT3) se activa en las células del blastocisto, las células de la masa celular interna se transforman en células madre pluripotentes (CME), y cuando se activa el segundo mecanismo de transducción de señales transmembrana (FGF2 - FGFR2 - MAP quinasa ERK1/ERK2), se forman células madre del trofectodermo en el blastocisto. La elección de la vía de señalización, a su vez, depende de la actividad del gen oct4. Este gen, que pertenece al dominio POU, se encuentra en el locus t del autosoma 17 y se expresa durante la ovogénesis, durante el período de escisión, así como en las células de la masa celular interna del blastocisto y en las células germinales primarias. El papel funcional del gen oct4 es codificar un factor de transcripción necesario para la emergencia de células pluripotentes, su diferenciación y desdiferenciación.

La expresión del gen oct4 en células madre embrionarias (CME) varía según la interacción de este factor de transcripción con cofactores. La regulación dirigida de la expresión de oct4 en blastocistos mostró que, cuando su actividad se reduce, la mitad de las células forman trofectodermo, mientras que, cuando la expresión inducida de oct4 aumenta, se forman predominantemente CME.

En el experimento, las ESC no pueden transferirse a una línea durante el cultivo de blastómeros totipotentes en la etapa de segmentación, así como en la etapa de gastrulación y etapas posteriores del desarrollo embrionario. Las ESC de ratón generalmente se aíslan entre el 3.5 y el 4.5 día de gestación, que corresponde a la sexta (blastocisto de una sola capa) y séptima etapa (blastocisto de dos capas - cilindro ovárico temprano) de la embriogénesis normal. Obviamente, solo en el período de preimplantación los embriones de ratón contienen poblaciones celulares capaces de transformarse en ESC. En consecuencia, el aislamiento de líneas de ESC solo es posible en ciertas etapas de la embriogénesis. El cigoto y los blastómeros que surgen durante la segmentación son totipotentes, desde el punto de vista de la posibilidad de desarrollar un embrión viable con membranas embrionarias y placenta. La pérdida de la potencia total de las células germinales comienza en la etapa tardía de la mórula, cuando el compromiso adicional de los blastómeros depende de su ubicación. Los blastómeros de la mórula temprana conservan la totipotencia, ya que las manipulaciones experimentales con cambios en su localización, como la inversión de su ubicación, no impiden el desarrollo de un embrión completo.

Se ha establecido que la eficiencia del aislamiento de células madre embrionarias (CME) en una línea se ve afectada por el estado de los blastocistos al momento de su explantación. El uso de blastocistos tras modelar una diapausa de siete días en el tracto reproductivo de ratones ovariectomizados el día 3,5 de gestación y tratados con progesterona facilita un aislamiento más exitoso de líneas de células madre embrionarias. Se supone que, en estas condiciones, aumenta el número de blastómeros que forman la masa celular interna. También es posible que el ciclo celular se alargue y que la mayoría de los blastómeros entren en la fase G0.

Además, la creación de líneas de ESC pluripotentes estables depende del genotipo de los embriones: las ESC se aíslan con relativa facilidad a partir de blastocistos de la línea de ratones 129, son mucho más difíciles de obtener utilizando ratones CS7BL/6, y es prácticamente imposible aislar una línea de ESC a partir de blastocistos de ratones CBA/Ca. Obviamente, los embriones en etapa temprana presentan características genéticas que afectan al desarrollo de una línea de ESC pluripotente. No obstante, al cultivar epiblastos aislados, así como mediante la selección selectiva de células diferenciadoras, se aislaron líneas de ESC a partir de embriones en etapa temprana de ratones CBA/Ca.

Una técnica estándar comprobada para obtener líneas de células madre embrionarias (CME) a partir de blastocistos se describe en los manuales de laboratorio sobre la técnica de experimentos con embriones tempranos. También se pueden obtener líneas de CME experimentales cultivando epiblasto aislado (ectodermo primario) de embriones de ratón de 4,5 días de edad mediante una técnica microquirúrgica bastante compleja y condiciones de cultivo modificadas. La complejidad de este procedimiento está justificada, ya que la frecuencia de formación de líneas de CME en este caso resultó ser significativamente mayor que en trabajos con la masa celular interna del blastocisto.

Para aislar las líneas de ESC, cada clon se transfiere a un micropocillo, se cultiva un agregado de 40 a 60 células y se dispersa de nuevo. Múltiples repeticiones de este procedimiento permiten obtener una línea de ESC inmortalizada con la máxima tasa de proliferación de células normocariotípicas adheridas al plástico, que conservan la totipotencia y una alta actividad telomerasa después de 50 a 100 pases. En el proceso de mantenimiento de las líneas de ESC, el mayor peligro es la contaminación del medio o suero con endotoxinas bacterianas; incluso concentraciones traza de endotoxina en el medio de cultivo causan la muerte masiva de células germinales inmaduras. Con un monitoreo cuidadoso del crecimiento lineal y una dispersión oportuna, las ESC en cultivo son capaces de una división simétrica, en la que ambas células hija permanecen pluripotentes y capaces de realizar un número ilimitado de ciclos celulares, manteniendo un cariotipo diploide y una potencia total.

La selección de una población pura de células madre embrionarias (CME) humanas puede realizarse tras la transfección de su genoma con moléculas de ADN recombinante que contienen el gen que codifica la síntesis de la proteína verde fluorescente (GFP). La expresión de GFP aumenta cuando las CME se cultivan en condiciones que favorecen su proliferación, mientras que con el inicio de la diferenciación, la expresión de este gen disminuye, lo que permite la selección de líneas celulares pluripotentes estables y puras en un medio selectivo. Al cultivar CME aisladas mediante selección con GFP, la frecuencia de formación de colonias se multiplica por mucho, ya que el potente efecto antiproliferativo de las células diferenciadas se elimina en las condiciones de los cultivos de selección.

La traducción de células madre embrionarias humanas a una línea se lleva a cabo mediante su aislamiento a partir de embriones preimplantacionales (en la etapa de 80-120 células), que quedan tras el procedimiento de fertilización in vitro. Para ello, los embriones sobrantes obtenidos artificialmente se dispersan mecánicamente en el medio Delbecco-Eagle. Tras marcar las células con anticuerpos monoclonales selectivos con un marcador fluorescente, se aíslan los embrioblastos. El embrioblasto se dispersa en células individuales utilizando una mezcla de dispasa-colagenasa. Las células disociadas se cultivan en un medio especial (80 % de medio Delbecco + 20 % de suero fetal bovino en presencia de 500 μg/ml de IL-6, LIF y SCF) sobre una monocapa alimentadora de fibroblastos embrionarios de los tres primeros pases. En este caso, la supervivencia y la proliferación de las células madre y progenitoras se mantienen gracias al efecto de IL-6, LIF y SCF. En dicho medio, las células madre embrionarias (CME) crecen como clones en suspensión de células no adheridas en forma de bola, que deben disociarse mediante pipeteo suave y repetido. Los nuevos clones aparecen en el cultivo suspendido entre el quinto y séptimo día. La tasa máxima de crecimiento de las CME se alcanza mediante la disociación repetida de clones en la etapa de 10 a 15 células. Luego, cada clon se transfiere a un micropocillo y se cultiva hasta un agregado de 40 a 50 células. El procedimiento se repite muchas veces en pases, aumentando el volumen del cultivo a una densidad de 5 a 10 millones de células por placa de 6 cm. Utilizando estos pases, Thomson aisló 10 clones inmortales de CME humanas, que después de 100 pases conservaron una alta actividad de la telomerasa, la capacidad de proliferar vigorosamente, características fenotípicas mínimas y potencia total con la capacidad de diferenciarse en cualquiera de las 350 líneas celulares especializadas derivadas del ectodermo, mesodermo y endodermo. La diferenciación de las células madre embrionarias humanas (CME) comenzó (tras el cambio de medio, la adición de suero y la eliminación de LIF) con la adhesión celular al sustrato, lo que indica el desarrollo del citoesqueleto y la expresión de receptores de adhesión. Cabe destacar que, con una proliferación ilimitada, las CME humanas mantuvieron un cariotipo normal.

El segundo método para aislar líneas celulares humanas de células madre embrionarias (CME) se basa en el uso de células germinales primarias. Estudios experimentales han demostrado que las líneas de células E pueden obtenerse de los pliegues genitales de embriones de ratón de 12,5 días de edad. Sin embargo, en estos casos, la frecuencia de formación de líneas celulares progenitoras fue significativamente menor que en experimentos con embriones de edad gestacional más temprana. Al mismo tiempo, las células germinales primarias de las gónadas de embriones de ratón de 13,5 días de edad gestacional no son capaces de transformarse en líneas.

Las primeras líneas estables de células EG humanas pluripotentes se obtuvieron a partir de gonocitos primarios aislados de las gónadas de embriones de 5 a 9 semanas de edad. Las células aisladas se cultivaron en un sustrato de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados en medio DMEM con suero fetal suplementado con mercaptoetanol, forskolina y factores de crecimiento humanos recombinantes (FGF y LIF). Después de 7-12 días, aparecieron colonias multicelulares en el cultivo, que se correspondían con células EG humanas por características morfológicas y marcadores moleculares. Después de la agregación, estas células formaron cuerpos embrionarios, con un mayor desarrollo de los cuales aparecieron células especializadas características de los derivados de las tres capas germinales. En el transcurso de 10-20 pases, las líneas celulares EG mantuvieron un cariotipo normal y no perdieron pluripotencia.

También se ha demostrado que la acción combinada de LIF, factores Steel solubles y unidos a la membrana, y TGF-β altera el programa de desarrollo de las células germinales primordiales. En lugar de detener las divisiones mitóticas y comenzar a diferenciarse hacia la ovogénesis o la espermatogénesis, las células germinales primordiales continúan proliferando. Tras varios ciclos mitóticos adicionales, se asemejan a las células del epiblasto y, al perder las propiedades de los precursores de células germinales, se transforman en células madre embrionarias pluripotentes (EG).

Así, en 1998, se aislaron por primera vez líneas inmortalizadas de células germinales primordiales del rudimento genital de tejido de autopsia fetal humana. En la embriogénesis humana, las células germinales primordiales aparecen en el saco vitelino en la tercera semana de desarrollo, y en la cuarta y quinta semanas, estas células migran a la zona del tubérculo genital, donde forman poblaciones latentes de gonocitos primarios. En un estado inactivo, las células germinales primordiales se conservan en el embrión hasta el nacimiento. Se aíslan líneas de células germinales primordiales del tubérculo genital fetal de embriones de 5 a 9 semanas, cuyo tejido extraído se trata ex tempore con una mezcla de colagenasas tipos IV-V, hialuronidasa y DNasa para aumentar el rendimiento cuantitativo y cualitativo de las células. Las células germinales primordiales en el tejido del tubérculo genital fetal están rodeadas por células de Sertoli estromales (mesenquimales). El propósito funcional de las células de Sertoli es producir factores antiapoptóticos (ligando Fas), mitógenos e inmunosupresores que protegen a las células germinales del ataque inmunitario del cuerpo. Además, el microambiente estromal del tubérculo genital desempeña un papel importante en la maduración de los gametos. Las células germinales primarias aisladas se siembran en cultivo sobre una capa estromal alimentadora que consiste en fibroblastos fetales de los tres primeros pases. La combinación más efectiva de mitógenos es un complejo que consiste en LIF, FGF y forskolina (un estimulador de la formación de AMPc). La proliferación de células germinales primarias in vitro requiere la adición de suero fetal, en presencia del cual la reproducción de gonocitos primarios en cultivo se acompaña de la formación de clones de células esféricas no unidas al sustrato.

En los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., basándose en un resumen de los datos existentes sobre métodos para aislar líneas celulares de células madre embrionarias humanas a partir de blastocistos, se llegó a la conclusión preliminar de que el aislamiento exitoso de células madre embrionarias es más probable al cultivar blastocistos con una masa celular interna bien formada (Células madre: progreso científico y futuras direcciones de investigación. Instituto Nacional de Salud de EE. UU.). Desde este punto de vista, la fuente óptima de células madre embrionarias para la creación de líneas son los blastocistos humanos al quinto día de desarrollo, de los cuales se debe extraer cuidadosamente el trofectodermo al aislar la masa celular interna. La masa celular interna aislada, que en esta etapa consta de 30-35 células, debe cultivarse en un sustrato de fibroblastos embrionarios de ratón, lo cual es una condición decisiva para la formación de colonias de células madre embrionarias en cultivo.

Análisis de las características fenotípicas de las células madre embrionarias

De particular interés es el análisis comparativo interespecie de las características fenotípicas de las ESC. Se encontró que las colonias de ESC humanas son grupos densos de células aplanadas, similares a epiteliales, mientras que los cuerpos embrionarios de ratón consisten en un conglomerado laxo de células redondeadas. En las ESC humanas, el índice de relación núcleo-plasma es menor que en las ESC de ratón. Las células madre embrionarias de monos forman colonias de células más planas con bordes irregulares. Las células individuales son fácilmente visibles en clones tempranos de ESC de primates. Las ESC proliferantes de todas las especies animales estudiadas no expresan moléculas MHC de clase I y II. Al mismo tiempo, las ESC humanas dan una reacción positiva a los anticuerpos TERA 1-60 y GCTM-2, lo que indica la presencia de proteoglicanos de queratina/sulfato de condroitina en su superficie, característicos de las células madre del embrión-(terato)-carcinoma. La expresión del gen oct4 en células madre embrionarias (CME) de todas las especies animales sugiere que, a pesar de las diferencias fenotípicas, el mismo conjunto de genes responsables del mantenimiento de la pluripotencia aparentemente se activa en células madre embrionarias humanas y murinas (Peru, 2001). Además, las líneas de CME aisladas de embriones de rata, cerdo, conejo, primate y ganado bovino presentan características morfológicas similares, un conjunto similar de marcadores de identificación molecular y un mecanismo molecular prácticamente idéntico para implementar programas de embriogénesis, lo que nos permite abordar el problema de los xenotrasplantes desde una nueva perspectiva.

A diferencia de la embriogénesis normal in vivo, la proliferación de células madre embrionarias in vitro no se acompaña de la formación de capas germinales y se produce en un contexto de bloqueo de los genes homeóticos Hox, es decir, sin organogénesis. Dado que los genes de segmentación no funcionan, es imposible reproducir períodos de la embriogénesis como la puesta de somitas, la segmentación del embrión, la formación del saco vitelino, la alantoides y otros órganos y tejidos provisionales en cultivos de células madre embrionarias. Las células madre embrionarias cultivadas parecen haberse congelado al inicio del proceso de formación de 350 líneas de restricción de células especializadas. Por lo tanto, un clon de células progenitoras hijas y una célula madre embrionaria de localización central representan solo un modelo de embrión, durante cuyo desarrollo se forman simultáneamente diferentes líneas de células especializadas en diferentes regiones tisulares, que, sin embargo, se originan a partir de precursores comunes. A pesar del mínimo nivel de receptores en la superficie de las células madre embrionarias (CME), estas conservan la capacidad de llevar a cabo procesos morfogenéticos primitivos, imitando las estructuras volumétricas de un embrión temprano: una suspensión de CME en cultivo se agrega y forma estructuras similares a blastocistos o incluso a embriones posteriores (cilindro ovárico). Estos agregados en suspensión se denominan, respectivamente, cuerpos embrionarios simples y complejos.

En la diferenciación mixta, los genes tempranos del ectodermo (oct3, fgf-5, nodal), endodermo (gata-4), mesodermo (brachyury), mesodermo cardiogénico (pkh-2.5), tubo neural (msx3) y hematopoyesis (elkf) se expresan simultáneamente en diferentes células de un mismo cuerpo embrionario. Mediante diversas combinaciones de factores de crecimiento y citocinas para la acción dirigida sobre la formación de células de la capa germinal in vitro, fue posible, en varios casos, obtener cuerpos embrionarios con expresión preferente de genes del ectodermo o del mesodermo, lo que facilita el modelado de la gastrulación y las fases iniciales de la organogénesis.

El crecimiento clonal de las células madre embrionarias (CME) evidencia una división celular asimétrica, en la que solo una CME en el centro del clon conserva un potencial de proliferación ilimitado, mientras que la segunda célula hija genera una generación de células progenitoras que ya se encuentran en proceso de diferenciación. Por lo tanto, la tasa de proliferación del clon en la periferia del cuerpo embrionario es mayor que en el centro. Las células marginales del clon en crecimiento experimentan una diferenciación desordenada espontánea, migran o mueren por mecanismos apoptóticos. Estos eventos determinan el destino del clon: si la tasa de proliferación excede la tasa de migración y muerte celular apoptótica, el clon continúa aumentando de tamaño, la estabilización ocurre cuando la tasa de apoptosis y la tasa de formación de nuevas células son iguales, y la regresión ocurre cuando la proporción de estos procesos es inversa. Las células progenitoras se dividen simétricamente, es decir, ambas células hijas se diferencian posteriormente en líneas celulares especializadas maduras. La proporción de CME con respecto a las células progenitoras varía, pero el número de CME siempre es solo una fracción del uno por ciento de la población de células progenitoras. Por lo tanto, solo un pipeteo cuidadoso y la desagregación oportuna de los clones pueden aumentar el número de ESC en el cultivo. La desagregación de clones en la etapa de 10-12 células resultó ser la más efectiva para obtener el máximo rendimiento de ESC. La dirección y el grado de diferenciación de las células en el cuerpo embrionario dependen de su ubicación. Las células externas del cuerpo embrionario no expresan el gen oct4 y experimentan diferenciación en células del endodermo primario, a partir del cual se forman posteriormente células similares a epiteliales del endodermo extraembrionario parietal y visceral. Las células internas del cuerpo embrionario expresan el gen oct4 y retienen la pluripotencia durante 48 horas de cultivo. Sin embargo, el cultivo luego se reestructura morfológicamente en una monocapa epitelial y comienza la expresión de genes que controlan el desarrollo del ectodermo primario. A continuación, el proceso de citodiferenciación desordenada total comienza con la aparición de varios tipos de células que son derivados de las tres capas germinales. En el proceso de diferenciación espontánea de las células del cuerpo embrionario, los primeros en aparecer son agregados con marcadores endodérmicos en forma de fragmentos (quistes) del saco vitelino. Posteriormente, en estas estructuras aparecen angioblastos y células endoteliales de los capilares en crecimiento. En las etapas finales de la diferenciación espontánea, diversas células terminalmente diferenciadas se desarrollan a partir de las células internas del cuerpo embrionario, incluyendo neuronas, elementos gliales, cardiomiocitos, macrófagos y eritrocitos. Hasta cierto punto (teniendo en cuenta la inversión espacial de la formación de las capas de tejido germinal), utilizando cuerpos embrionarios, es posible estudiar los procesos morfogenéticos in vitro y analizar los mecanismos moleculares de los períodos iniciales de la citodiferenciación embrionaria.así como establecer el papel de genes específicos en la implementación de estos procesos.

Así, dentro del clon hay células en las que se han descubierto diferentes programas de desarrollo genético: ESC, progenitores tempranos y poblaciones progenitoras diferenciadoras. El cultivo de ESC mediante métodos de gota colgante o cultivo masivo sin una capa alimentadora y sin añadir LIF al medio conduce inevitablemente a la formación de cuerpos embrionarios. La morfología de las células de las capas externa e interna de los cuerpos embrionarios difiere. La capa externa consta de células grandes y ramificadas. Su superficie orientada al entorno está cubierta de numerosas microvellosidades. La capa externa de células está separada de la capa interna por una membrana basal parecida a la membrana de Reichert, mientras que las células de la capa interna de los cuerpos embrionarios son epitelio columnar. Morfológicamente, la capa interna, aunque contiene muchas células en división, se parece más a colonias indiferenciadas de ESC.

Características de las células madre embrionarias humanas

La ausencia de interacciones de señalización parenquimatosa-mesenquimal, en el contexto del bloqueo del gen homeótico, provoca un crecimiento desordenado de las células madre embrionarias (CME) en cultivo, lo que altera la formación y el desarrollo de la infraestructura de los órganos provisionales. El crecimiento desorganizado y la diferenciación espontánea desordenada de las CME en cultivo se deben a la ausencia de marcaje mesenquimal de la estructura estromal de los futuros órganos: in vitro, es posible formar millones de hepatocitos, pero es imposible obtener un solo lóbulo hepático que incluya elementos estructurales y funcionales como senos, espacios de Disse y células de Kupffer.

Se cree que la pluripotencia de las células madre embrionarias (CME) se realiza exclusivamente en la embriogénesis, con la formación de los tejidos y órganos del embrión, mientras que la placenta y el cordón umbilical son derivados del trofoblasto. Las CME, encerradas en la membrana trofectodérmica, generan secuencialmente clones de células provisionales que implementan el programa de desarrollo mediante el ARNm combinatorio de la matriz topográfica volumétrica de Nokhteyov. Estos clones predeterminan la disposición espacial, la forma y el tamaño, el número de células de los órganos provisionales y definitivos, así como el ensamblaje del parénquima en unidades estructurales y funcionales. Al mismo tiempo, las CME siguen siendo el único tipo de célula en el que el mecanismo molecular para la implementación de sus potencias está completamente desconectado del programa de desarrollo genético, y las propias CME se ven privadas de la capacidad de interactuar con otras células debido al bloqueo de las percepciones de los receptores y de los sistemas de transseñalización. Sin embargo, la activación adecuada de las células madre embrionarias (CME) conduce a un desarrollo gradual del programa de embriogénesis, que culmina con el nacimiento de un organismo completamente formado, compuesto por miles de millones de células, listo para la vida extrauterina. En este camino a corto plazo, pero inimaginablemente largo, en el espacio celular, inevitablemente surgen errores tanto en los mecanismos moleculares que aseguran la actividad vital de las células como en los programas que controlan su proliferación, diferenciación y especialización. Por lo tanto, en la farmacogenómica moderna, las enfermedades de la estructura molecular y las enfermedades de la programación celular se consideran por separado. Además, la acción de la mayoría de los nuevos fármacos se dirige a corregir los programas de diferenciación, proliferación y organogénesis, así como a la regeneración de órganos y tejidos. En un organismo adulto, las CME permiten controlar el comportamiento de las células madre/progenitoras trasplantadas al cerebro, hígado, bazo, médula ósea y otros órganos humanos para restaurar el parénquima dañado de los órganos del receptor mediante la diferenciación y especialización de las células del donante en la matriz mesenquimal preservada. En esencia, el programa de totipotencia comienza a materializarse a nivel de los genomas del ovocito, cigoto y blastómero; sin embargo, estas células aún no se han clonado ni pasado en las cantidades necesarias para las necesidades de la medicina experimental y práctica. Por lo tanto, las células madre embrionarias (CME) siguen siendo una fuente única de información genética que contiene códigos para un mapa tridimensional del embrión y códigos para la restricción lineal de líneas celulares especializadas durante la gastrulación.

El potencial regenerativo prácticamente ilimitado de las células madre embrionarias (CME) se debe a que su genoma, a diferencia del aparato genético de las células somáticas diferenciadas, conserva la pluripotencia. Una de las manifestaciones del estado latente de la información genética presente en las CME es el llamado fenotipo mínimo: un número limitado de receptores se expresa en la superficie de las CME y, en consecuencia, se despliegan muy pocos programas de transseñalización para la interacción del aparato nuclear celular con su microambiente. En el contexto de la hibernación de los genes responsables de la restricción de líneas celulares especializadas y la diferenciación celular, solo se activan unos 30 de los 500 genes, cuyos productos aseguran la conexión de la célula con el microambiente circundante. Mediante el método de análisis serial de la expresión génica, se demostró que, con la función común de las principales regiones funcionales del genoma que regulan la energía y el metabolismo en células somáticas y células madre embrionarias (CME), estas últimas presentan un nivel muy bajo de ARNm de receptores, proteínas G, mensajeros secundarios, transcriptasas y cofactores de expresión y represión, es decir, de todo el sistema de transmisión transmembrana de la señal reguladora a la célula. Esto se debe a la ausencia o baja expresión de genes de transseñalización. Durante el período de diferenciación inducida en el genoma de las CME, 18 genes funcionales dejan de funcionar simultáneamente, mientras que 61 genes de transseñalización controlan la síntesis de receptores de adhesión celular, componentes de la matriz extracelular, transcriptasas de restricción y elementos mensajeros del sistema de transmisión de señales al aparato nuclear desde los receptores de la membrana plasmática celular. Al mismo tiempo, se bloquea la expresión de genes responsables de la síntesis de proteínas silenciadoras, así como de coinhibidores de la expresión génica que aseguran la totipotencia del genoma de las CME.

Se han encontrado marcadores genéticos para células de las tres capas germinales. La identificación de la capa celular ectodérmica se lleva a cabo mediante la expresión de los genes nodales, oct3 y fgf-5; las células del mesodermo, mediante los genes brachyury y zeta-globina; y el endodermo, mediante la expresión del gen gata-4. En la embriogénesis normal, durante el período de gastrulación, se observa una migración activa de poblaciones inmaduras de células madre y progenitoras, que marcan localmente las zonas de desarrollo de los huesos faciales del cráneo, algunas partes del cerebro, el sistema nervioso periférico, el sistema de conducción cardíaca y el timo, cuyos tejidos se forman a partir de clones de células migrantes. El marcado de células mediante genes tempranos de las capas germinales facilita el análisis topográfico de los procesos de migración de células precursoras en el embrión en desarrollo. Se ha establecido, en particular, que en agregados de células de embriocarcinoma P19, la expresión del primer gen del mesodermo, brachyury, comienza durante el período de disminución de la expresión de los genes del activador tisular del plasminógeno, la α-fetoproteína, la queratina 8 y la queratina 19, marcadores de las primeras poblaciones migratorias del mesodermo. En consecuencia, la formación de tejidos de origen mesodérmico comienza solo tras la finalización del proceso de migración puntual y dispersión de las células progenitoras mesodérmicas.

A pesar de las características fenotípicas extremadamente limitadas y la ausencia de la mayoría de las unidades de transseñalización, las células madre embrionarias (CME) aún expresan algunas moléculas receptoras que pueden usarse para su identificación. Cabe destacar que los antígenos marcadores de CME en humanos y primates resultaron ser comunes. Con mayor frecuencia, se utilizan anticuerpos marcados para los antígenos unidos a la membrana SSEA-3, SSEA-4 (antígenos lipídicos únicos que representan un complejo de glicolípido GL7 con ácido siálico), así como las glicoproteínas de alto polímero TRA-1-81, TRA-1-60 para el marcaje de CME. Además, las CME expresan el antígeno embrionario específico SSEA-1 y la fosfatasa alcalina endógena, así como el factor de transcripción específico Oct4. Este último es necesario para mantener los mecanismos de proliferación de las CME: el factor de transcripción específico Oct4 activa la expresión del gen del factor de crecimiento de fibroblastos 4 y estabiliza la expresión de la caja de genes responsable de la replicación ilimitada del ADN en células inmaduras. Las proteínas marcadoras intracelulares más importantes son Oct3, Oct4, Tcf y Groucho, que están relacionadas con las proteínas silenciadoras de la cromatina.

Casi inmediatamente después de muchos años de intentos exitosos de cultivar ESC fuera del cuerpo y de obtenerse los primeros cultivos de células madre aisladas de blastocistos de ratón y cultivos de células germinales primarias, comenzó una etapa de investigación sobre el potencial pluripotente de las ESC al introducirlas en embriones en etapas tempranas de desarrollo. Se demostró que en las etapas de mórula y blastocisto, las ESC son capaces de formar embriones quiméricos en los que se detectan los descendientes de las ESC donantes en todos los tejidos somáticos e incluso en los gametos. Así, en biología del desarrollo, utilizando ESC, se estableció un "puente" entre los estudios experimentales in vivo e in vitro, lo que amplió significativamente las posibilidades de estudiar los procesos de formación de tejidos y órganos primarios, su diferenciación y la organogénesis embrionaria.

Está claramente establecido que, in vivo, durante la embriogénesis, las células madre embrionarias (CME) se integran en la masa celular del embrión temprano, y sus derivados se encuentran en todos los órganos y tejidos. Las CME colonizan una línea de células germinales en el embrión quimérico, cuyos descendientes forman óvulos y espermatozoides completos. Las células madre embrionarias son clonogénicas: una sola CME es capaz de crear una colonia de células genéticamente idéntica con marcadores moleculares, como la expresión del gen oct4 y la fosfatasa alcalina, una alta actividad de la telomerasa y la expresión de ciertos antígenos embrionarios.

Para estudiar los mecanismos de embriogénesis mediante células madre embrionarias (CME), se ha desarrollado un método de quimerización de mórulas mediante la creación de una construcción biológica, en cuyo exterior se encuentra una capa de blastómeros tetraploides del receptor, y en su interior se introducen CME donantes. De este modo, el trofoblasto se forma a partir de los descendientes de los blastómeros tetraploides del receptor, lo que asegura la implantación y la placentación, y las CME donantes actúan como una masa celular interna a partir de la cual se forman el cuerpo de un embrión viable y una línea de células germinales progenitoras primarias. El valor de las CME para la investigación reside no solo en que se preserva la pluripotencia durante las manipulaciones in vitro con su genoma, sino también en que se preserva su capacidad para participar en la formación de células germinales primarias de un embrión quimérico. Se ha demostrado que los descendientes de una sola CME genéticamente modificada pueblan todos los rudimentos primarios y tejidos en desarrollo de un embrión quimérico obtenido por agregación o cocultivo de esta célula con un embrión de 8 células. Al trasplantar células madre embrionarias (CME) transfectadas con el gen de la proteína verde fluorescente a la mórula de ratones, se encontraron descendientes fluorescentes de esta célula en todos los tejidos estudiados del embrión en desarrollo (Shimada, 1999). El trasplante de CME a la mórula permite la creación de ratones viables cuyo organismo se compone únicamente de los descendientes de la CME donante, lo que abre la posibilidad de diversas opciones para la clonación terapéutica. Este enfoque metodológico se utiliza actualmente con éxito para estudiar problemas de biología del desarrollo; en particular, para analizar los mecanismos de inactivación genética del cromosoma X o la inestabilidad epigenética de las CME. El trasplante de CME a un embrión en etapa temprana también se utiliza en biotecnología agrícola, así como en experimentos de terapia génica.

El trasplante de células madre embrionarias (CME) modificadas genéticamente se utiliza para evaluar la presencia de genes mutantes en células diana. En biotecnología, se utilizan células madre embrionarias cultivadas in vitro para crear ratones knockout. Para ello, se extrae el gen a estudiar de las CME mediante recombinación homóloga (knockout) y las células que carecen de este gen se aíslan en medios selectivos. Posteriormente, las CME knockout se introducen en el blastocisto o se agregan con blastómeros de mórula. Los embriones quiméricos tempranos obtenidos de esta manera se trasplantan a hembras receptoras, y se seleccionan individuos con gametos nulicigotos para un gen determinado entre los ratones recién nacidos. Esta tecnología se ha utilizado para crear numerosas líneas de ratones knockout, ampliamente utilizadas en biología y medicina experimental. Dichos modelos biológicos se utilizan para estudiar la importancia de ciertos genes en el desarrollo embrionario, así como su papel en los mecanismos de enfermedades y patologías humanas. Además, las líneas animales knockout se utilizan en las pruebas preclínicas de nuevos métodos de terapia génica. Por ejemplo, al transfectar el alelo normal de un gen mutante en el genoma de una ESC, es posible corregir eficazmente una mutación que afecta al sistema hematopoyético. La introducción de genes foráneos en las ESC permite la rápida creación de líneas de animales de laboratorio transgénicos homocigotos. Sin embargo, cabe destacar que la técnica de deleción génica por recombinación dirigida hasta el momento solo se ha desarrollado de forma fiable en relación con las ESC de ratón. Utilizando ESC de ratón con doble knockout, se estableció el papel funcional de la región del grupo de genes en el cromosoma 7 (una copia de la región genómica en el cromosoma 19 humano) y la región proximal del cromosoma 11 (una copia del cromosoma 5g humano). La deleción de estos genes en las ESC de ratón permitió evaluar la función de sus análogos en humanos.

Las posibilidades de estudiar la función de los genes de la embriogénesis humana se han ampliado. Su transfección al genoma de células madre embrionarias (CME) de animales de laboratorio ha permitido, en particular, aclarar el papel del gen cripto en la formación y el desarrollo del mesodermo cardiogénico, y del gen pax-6 en la embriogénesis ocular. Se están compilando los primeros mapas de expresión génica en CME inmaduras proliferantes de teratocarcinoma y blastocistos de ratones, y se ha confirmado la represión supresora de genes de transseñalización en CME. La combinación de 60-80 CME mutantes y 20-30 células de embriones de ratón normales preimplantados conduce al desarrollo de embriones quiméricos cuyos primordios orgánicos están compuestos por células donantes y receptoras, lo que permite aclarar el papel de genes desconocidos en la gastrulación y la organogénesis. El mapa funcional de los genes de los embriones de ratón en desarrollo se complementó con información sobre el papel del gen sf-1 en la formación de la glándula suprarrenal y las gónadas, el gen wt-1 en la formación del riñón, los genes de la familia myoD en la formación del músculo esquelético y los genes de la familia gata-1-4 en la maduración por restricción de los rudimentos de la eritropoyesis y la linfopoyesis.

La desactivación dirigida de alelos maternos y paternos en células madre embrionarias (CME) mediante recombinasas vectoriales permitió esclarecer las funciones de diversos genes en el período temprano de la embriogénesis, y la tecnología de transferencia dirigida de genes humanos desconocidos a CME de ratón contribuye al descubrimiento de nuevos genes mutantes responsables del desarrollo de patología hereditaria grave. Mediante el método de knockout, se determinó la importancia obligatoria de algunos genes para la formación de tejidos embrionarios: gata-4 para el miocardio, gata-1 para el linaje eritroide del tejido hematopoyético, myoD para el músculo esquelético, brachyury para el mesodermo, las transcriptasas de restricción hnf3 y hnf4 para las células madre hepáticas, y rag-2 para la formación de clones de linfocitos T y B (Repin, 2001). La doble deleción de genes en células madre embrionarias (CME) ha abierto el acceso al estudio del papel funcional de los genes de la capa germinal, la segmentación y la homeosis, y el trasplante de CME ha hecho posible la obtención de embriones híbridos interespecies viables. Mediante una técnica mejorada para trasplantar una CME de un solo donante a un embrión de 8 células, se ha demostrado la quimerización a nivel celular de muchos órganos del embrión receptor. Cabe destacar que se han encontrado brotes celulares de tejido humano en los órganos de ratones receptores tras la introducción de células madre hematopoyéticas humanas en el blastocisto. Se ha establecido que las CME pluripotentes circulan en la sangre de embriones de ratón durante el período de formación de órganos. Es posible que su función biológica resida en la organización embrionaria del futuro sistema inmunitario. Con la ayuda de las células madre embrionarias (CME), se han reproducido en condiciones de laboratorio modelos adecuados de patología genética humana: la doble inactivación del gen de la distrofina modela la distrofia muscular de Duchenne en ratones, y la desactivación del gen atm (que controla la síntesis de la quinasa señal de la cromatina) — ataxia-telangectasia. En esta enfermedad hereditaria mortal en niños, la degeneración de las células de Purkinje en el cerebelo se desarrolla debido a defectos en la reparación del ADN, que se acompaña de la involución del timo debido a la muerte de las células proliferantes. El cuadro clínico, la fisiopatología y la patomorfología de la ataxia-telangectasia, reproducidos mediante la introducción de información genética patológica en las CME, en ratones quimera corresponden a los de los humanos. Además de la ataxia-telangectasia, utilizando células madre embrionarias y ratones knockout, se han desarrollado modelos experimentales de algunas enfermedades humanas homocigotas hereditarias asociadas con la patología del metabolismo de carbohidratos y lípidos, el catabolismo de aminoácidos y la excreción de cobre y bilirrubina, lo que ha ampliado significativamente las capacidades de la medicina experimental en la etapa de pruebas preclínicas de nuevos métodos para tratar las enfermedades humanas correspondientes.

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Uso de citohíbridos de células madre

Las células híbridas obtenidas mediante la fusión de células madre embrionarias (CME) con células somáticas constituyen un modelo adecuado y prometedor para el estudio de la pluripotencia de las células madre y la reprogramación de los cromosomas de células diferenciadas. Los citohíbridos obtenidos mediante la fusión de CME con células diferenciadas de un animal adulto permiten estudiar las relaciones entre genomas de diferentes edades: una situación singular surge cuando cromosomas homólogos, originarios de células en diferentes etapas de diferenciación y distintos grados de madurez, se encuentran en el mismo núcleo, donde pueden intercambiar fácilmente señales reguladoras transactivas. Es difícil predecir cómo reaccionarán los sistemas epigenéticos cisreguladores de los cromosomas homólogos, formados durante el desarrollo individual, a la influencia de las señales transactivas que emanan de genomas embrionarios emparentados. Además, la segregación de los cromosomas parentales ocurre en las células híbridas, lo que permite estudiar la interacción de los genomas a nivel de cromosomas individuales, es decir, identificar potencialmente la participación de cromosomas específicos en el mantenimiento de la pluripotencia o, por el contrario, en el inicio de la diferenciación.

Los citohíbridos obtenidos mediante la fusión de células pluripotentes de teratocarcinoma y células somáticas diferenciadas se utilizaron como el primer modelo experimental para estudiar la interacción de genomas con diferentes "historias de desarrollo". En algunos casos, estas células híbridas conservaron propiedades pluripotentes a un nivel bastante alto. En particular, in vivo, las células híbridas teratocarcinoma-somáticas indujeron el desarrollo de verdaderos teratomas que contenían derivados de las tres capas germinales, e in vitro, en cultivos en suspensión, formaron cuerpos embrionarios. Incluso en citohíbridos interespecíficos de este tipo, se observó la presencia de antígenos embrionarios en los casos en que los socios somáticos en la fusión con células de teratocarcinoma eran linfocitos o timocitos. Cabe destacar que los citohíbridos creados mediante la fusión de células de teratocarcinoma con fibroblastos correspondieron a fibroblastos en fenotipo.

El hecho más importante establecido es que en las células híbridas de teratocarcinoma-somático, aparecieron signos de reprogramación del genoma celular diferenciado, caracterizado por la reactivación de genes individuales o del cromosoma X inactivo de la pareja somática. Por lo tanto, los resultados de estudios sobre citohíbridos del tipo de célula teratocarcinoma-somático indican que la pluripotencia a menudo se conserva en las células híbridas y existen signos de reprogramación del genoma de la pareja somática.

En experimentos para obtener células híbridas embrionarias intraespecíficas mediante la fusión de células madre embrionarias de ratón con esplenocitos adultos, se estudiaron las características de dichos citohíbridos, se analizó la segregación de los cromosomas parentales y se evaluó la pluripotencia del genoma híbrido. Las células híbridas intraespecíficas obtenidas mediante la fusión de células de teratocarcinoma con células somáticas suelen caracterizarse por un bajo nivel de segregación cromosómica con un cariotipo tetraploide o casi tetraploide. Se observó una composición cromosómica similar en los citohíbridos durante la fusión de células germinales primarias con linfocitos. Al mismo tiempo, las células híbridas interespecíficas obtenidas mediante la fusión de células de teratocarcinoma de ratón con linfocitos de visón mostraron una intensa segregación de los cromosomas de la pareja somática.

Una etapa cualitativamente nueva en el estudio de la segregación de los cromosomas parentales en híbridos intraespecíficos comenzó después del desarrollo de un método para analizar microsatélites mediante la reacción en cadena de la polimerasa, gracias al cual se encontraron varios cientos de marcadores para cada cromosoma del ratón, permitiendo una discriminación confiable de cualquier par de cromosomas homólogos en células híbridas.

Mediante la fusión de células madre embrionarias (células HM-1 deficientes en actividad de hipoxantina fosforribosiltransferasa, 2n = 40, XY, aisladas de blastocistos de ratones 129/01a) con esplenocitos de ratones DD/c congénicos, fue posible obtener un conjunto de clones híbridos morfológicamente similares a las células madre embrionarias. Todos los clones se aislaron en un medio selectivo en el que solo pueden crecer células con hipoxantina fosforribosiltransferasa activa. El análisis electroforético mostró que todos los clones tenían una variante alélica de la hipoxantina fosforribosiltransferasa característica de los ratones DD/c. El análisis citogenético mostró que tres de los cuatro clones híbridos tenían un conjunto de cromosomas casi diploide. Un clon casi tetraploide contenía dos poblaciones de células híbridas, una de las cuales era tetraploide y la segunda, más pequeña, era diploide.

El análisis de microsatélites, que permite la discriminación de cualquier par de cromosomas homólogos de los ratones 129/01a y DD/c, en clones híbridos con un conjunto casi diploide mostró que en dos clones hubo una clara eliminación preferencial de los autosomas de la pareja somática. La mayoría de los autosomas en los clones HESS2 y HESS3 tenían marcadores de la línea 129/01a, es decir, la pareja pluripotente. La excepción fueron los cromosomas 1 e I: en los clones HESS2 y HESS3, junto con los marcadores de células HM-1, los marcadores de la pareja somática estaban presentes en pequeñas cantidades. Estos resultados pueden reflejar una segregación incompleta de los cromosomas 1 e I de la pareja somática y son consistentes con los datos citogenéticos que indican que la trisomía para estos cromosomas se observa en el 30-40% de las células de los clones HESS2 y HESS3. El clon HESS4 difirió significativamente en su composición cromosómica: muchos autosomas de este clon se originaron a partir del genoma de la ESC (cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 y 17), pero los cromosomas 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 y 19 estaban representados por homólogos de ambos progenitores. La proporción cuantitativa de microsatélites que marcaban estos cromosomas homólogos fue de aproximadamente 1:1. Esto permitió a los autores asumir que un homólogo se originó a partir del genoma de la ESC y el otro a partir de células diferenciadas. En algunos subclones del clon HESS4, solo estaban presentes los marcadores de los cromosomas 18 y 19 de la pareja somática. Los resultados obtenidos indican que en las células del clon HESS4, además de la segregación de los cromosomas de la pareja somática, se produjo la eliminación de uno o ambos homólogos de los cromosomas enumerados anteriormente del genoma pluripotente, es decir, hubo una segregación bilateral de los cromosomas de ambos progenitores, un fenómeno muy inusual, ya que la segregación de los cromosomas de solo uno de los progenitores es característica de los citohíbridos.

Además, después del vigésimo pase, todos los clones de células híbridas contenían únicamente marcadores del cromosoma X de la pareja somática; es decir, el cromosoma X de la ESC fue reemplazado por el cromosoma X de la pareja somática en los clones. Este importante hecho se confirma mediante datos de hibridación in situ utilizando una sonda marcada con FITC específica para el cromosoma X de ratón: se detectó una señal positiva solo en un cromosoma. Cabe destacar que en etapas anteriores del cultivo (antes del decimoquinto pase), según datos citogenéticos, muchas células contenían dos cromosomas X. Por lo tanto, el uso de medios selectivos permite manipular la composición cromosómica de las células híbridas y seleccionar selectivamente clones portadores de cromosomas individuales de la pareja somática frente al genoma de la ESC.

Dado que una característica única del genoma citohíbrido es la localización de los genomas parentales en un solo núcleo, surge naturalmente la pregunta sobre la preservación de las propiedades pluripotentes del genoma embrionario en híbridos de células madre embrionarias (CME) y células somáticas en condiciones de estrecho contacto con el genoma de una célula diferenciada. Morfológicamente, los citohíbridos de las CME y las células somáticas fueron similares a la línea parental de CME. La evaluación de la pluripotencia mostró que todos los clones con un conjunto de cromosomas casi diploide fueron capaces de formar cuerpos embrionarios en cultivos en suspensión, en los que estaban presentes derivados de tres capas germinales.

La mayoría de las células híbridas contenían el antígeno ECMA-7, un marcador característico de los embriones de ratón en sus primeras etapas, y también presentaban una alta actividad de fosfatasa alcalina. Los datos más convincentes sobre las altas propiedades pluripotentes de las células híbridas se obtuvieron en experimentos para obtener una serie de quimeras de inyección con células híbridas del clon HESS2. El análisis de marcadores bioquímicos mostró que los descendientes de las células híbridas donantes estaban presentes en la mayoría de los tejidos de las quimeras. Por lo tanto, las células híbridas obtenidas mediante la fusión de células madre embrionarias (CME) y células somáticas diferenciadas conservan un alto nivel de pluripotencia, incluyendo la capacidad de formar quimeras al inyectarse en la cavidad del blastocisto.

Los clones HESS2 y HESS4 difirieron significativamente en la composición de los cromosomas parentales, pero presentaron propiedades pluripotentes similares. Podría asumirse que la pluripotencia en el genoma híbrido se manifiesta como un rasgo dominante, pero es posible que no todos los cromosomas del genoma embrionario participen en el proceso de mantenimiento de la pluripotencia. Si esta suposición es correcta, cabe esperar que la eliminación de algunos cromosomas de la pareja pluripotente del genoma de las células híbridas no se acompañe de un cambio en su estado pluripotente. En este caso, el análisis de la segregación de los cromosomas parentales en las células híbridas embrionarias nos permitiría aproximarnos a la identificación de los cromosomas responsables del control de la pluripotencia en las células embrionarias.

O. Serov et al. (2001) no encontraron descendencia entre 50 crías obtenidas mediante el cruce de quimeras con ratones normales con genotipo 129/01a y cromosoma X de ratones DD. Los autores creen que esto se debe a una disminución de la pluripotencia en células híbridas bajo la influencia del genoma somático. Una explicación alternativa podría ser el efecto negativo de la trisomía en algunos autosomas y el desequilibrio en los cromosomas sexuales (XXY se observaron en células hasta el 15.º pase) en células híbridas durante la meiosis. Se sabe que las células XXY son incapaces de experimentar meiosis y formar gametos. La trisomía también puede causar una disminución de la actividad proliferativa de las células híbridas, por lo que la ventaja selectiva en el desarrollo de quimeras podría pertenecer a las células del embrión receptor. Por lo tanto, para una evaluación adecuada del potencial pluripotente de las células híbridas, es necesario obtener clones híbridos con un conjunto diploide normal de cromosomas.

En los experimentos de O. Serov y coautores (2001), se demostró por primera vez la posibilidad de reprogramar el cromosoma X de una célula somática en el genoma de células híbridas. Esta conclusión de los autores se desprende del análisis de la expresión del gen hprt (un marcador del cromosoma X) en quimeras: se detectó la presencia de la variante alélica de hprt de ratones DD/c en todos los tejidos quiméricos analizados. Cabe destacar que, tras la introducción de células híbridas en la cavidad del blastocisto, los citohíbridos caen en condiciones no selectivas, y la preservación del cromosoma X en el genoma de las células híbridas significa que se ha convertido en su componente obligado y el genoma no lo discrimina del cromosoma Y de la pareja pluripotente.

Resumiendo los resultados del análisis de la interacción de los genomas somático y pluripotente en células embrionarias híbridas, los autores concluyen que, en algunos citohíbridos, la pluripotencia se manifiesta como un rasgo dominante. El genoma híbrido es capaz de reprogramar cromosomas individuales de células diferenciadas, lo que, sin embargo, no excluye la posibilidad de un efecto inverso del genoma somático sobre la pluripotencia del genoma embrionario. Al cultivar células híbridas, la inducción de la diferenciación ocurre considerablemente con mayor frecuencia que en la línea parental original de células madre embrionarias HM-1. Se observa un efecto similar durante la formación de colonias primarias: muchas colonias primarias de células híbridas embrionarias se diferencian en etapas tempranas de formación con grandes pérdidas de clones durante su selección y reproducción.

Así, los citohíbridos creados por la fusión de células madre embrionarias (CME) con células somáticas, a pesar del estrecho contacto con el genoma de las células diferenciadas, conservan la pluripotencia como una propiedad única del genoma embrionario. Además, en dichas células híbridas, es posible la reprogramación de cromosomas individuales originados de células diferenciadas. Sigue sin estar claro hasta qué punto se conservan las propiedades pluripotentes del genoma embrionario en las células híbridas, en particular, su capacidad para participar en la formación de la línea germinal en quimeras. Esto requiere la obtención de células híbridas embrionarias con un cariotipo normal. En cualquier caso, las células híbridas embrionarias pluripotentes pueden convertirse en un verdadero modelo genético para identificar los cromosomas implicados en el mantenimiento o control de la pluripotencia, ya que la segregación bilateral de los cromosomas parentales potencialmente proporciona dicha oportunidad.

No menos atractivo es el estudio del fenómeno que O. Serov et al. (2001) definen como “memoria cromosómica”. En el genoma híbrido, los cromosomas homólogos se encuentran en dos configuraciones alternativas: los homólogos de la pareja somática ya se han diferenciado, mientras que en los homólogos de la pareja pluripotente este proceso apenas está comenzando. En consecuencia, la preservación de altas propiedades pluripotentes por las células híbridas indica que la configuración “pluripotente” de los homólogos de ESC es suficientemente estable en el genoma híbrido, a pesar de la influencia de factores transaccionales que emanan de la pareja somática. Los signos de reprogramación de los cromosomas homólogos del genoma diferenciado durante el desarrollo de quimeras descritos anteriormente no excluyen la posibilidad de que en las primeras etapas de formación y cultivo de citohíbridos in vitro conserven su estado adquirido durante la diferenciación in vivo. Según datos recientes, al transferir células híbridas embrionarias a un entorno no selectivo, presentan una eliminación intensiva de cromosomas únicamente de la pareja somática; es decir, el genoma de las células híbridas discrimina fácilmente homólogos tras un cultivo in vitro de 10 a 15 pases. Por lo tanto, las células híbridas embrionarias representan un modelo experimental prometedor para estudiar no solo una propiedad fundamental del genoma embrionario, como la pluripotencia, sino también su alternativa: la diferenciación embrionaria.

Eficacia terapéutica del trasplante de células madre embrionarias

Antes de analizar la eficacia terapéutica del trasplante de células madre embrionarias (CME) y sus derivados, resumimos el material anterior. La capacidad de las CME para la plena implementación de la embriogénesis in vitro es insuficiente, ya que los defectos de desarrollo en este caso se deben a la ausencia de células madre mesenquimales, que surgen en el organismo de forma autónoma e independiente de las CME. El potencial genético de las CME es menor que el del cigoto, por lo que no se utilizan directamente para la clonación de embriones. El potencial biológico único de las CME, como las únicas células en las que los programas de desarrollo se despliegan plenamente de forma consistente, se utiliza en estudios de la función génica. Con la ayuda de las CME, se decodifican las primeras combinaciones de señales que activan la expresión de genes tempranos y tardíos que codifican el desarrollo de las tres capas germinales. La preservación de la pluripotencia del genoma de las CME in vitro las convierte en una herramienta única para la regeneración reparadora, capaz de reponer automáticamente las pérdidas celulares en caso de daño a órganos y tejidos. En un escenario hipotético ideal, se puede suponer que “... al trasplantar células madre de donantes, se transfieren al cuerpo del receptor programas compactados que, en condiciones favorables, se realizan en la construcción de nuevo tejido'7, capaz de “... integrarse eficazmente en el cuerpo del receptor tanto a nivel morfológico como funcional”.

Naturalmente, tras el desarrollo de métodos para la monodiferenciación de células madre embrionarias (CME), se inició el estudio in vivo de la actividad funcional de células obtenidas in vitro a partir de un clon especializado. Un clon de CME proliferante genera poblaciones de células progenitoras migratorias capaces de integrarse activamente en áreas con daño tisular del receptor, lo cual se utiliza en medicina regenerativa-plástica. Se ha demostrado que el trasplante de neuronas DOPA en la sustancia negra reduce las manifestaciones clínicas en el hemiparkinsonismo experimental. Los trasplantes regionales de células madre neuronales de donantes reducen el grado de trastornos motores causados por traumatismos o contusiones de la médula espinal y el cerebro. También se han obtenido los primeros resultados positivos del trasplante de células madre en enfermedades desmielinizantes. Parece que el potencial regenerativo-plástico de las CME abre posibilidades ilimitadas para el uso del trasplante celular en la medicina práctica. Sin embargo, al trasplantarse en zonas ectópicas, las CME inevitablemente se transforman en tumores. Se forman teratomas cuando se inyectan CME por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Cuando se trasplantan suspensiones de células madre embrionarias (CME) bajo la cápsula testicular en ratones singénicos, también se forman teratomas, compuestos por diferentes tejidos, cuyas células derivan de las tres capas germinales. En estos teratomas, los procesos de organogénesis reducida son extremadamente raros.

Diversos estudios aportan información sobre los resultados positivos del trasplante de derivados tempranos de células madre embrionarias (CME) a animales con patología experimental. El neurotrasplante celular con derivados de CME se está desarrollando en experimentos y en los primeros ensayos clínicos para corregir trastornos funcionales en lesiones cerebrales y espinales, así como para tratar la siringomielia y la esclerosis múltiple (Repin, 2001). Con la llegada de la técnica de neurogénesis in vitro a partir de CME, en lugar de utilizar tejido cerebral embrionario, se están desarrollando métodos para trasplantar derivados de neuroesferas obtenidos de cultivos de tejido nervioso embrionario. Estas suspensiones de trasplante son significativamente más homogéneas y contienen precursores comprometidos de neuronas y neuroglia.

Con la adición regular de ácido retinoico a una dosis de 10 μg/ml al medio de cultivo durante 6 semanas, se forman más del 80% de las neuronas postmitóticas en la línea de embrión-(terato)carcinoma humano NTERA-2. La homogeneidad completa de la población neuronal se logra mediante la clasificación de flujo de neuronas maduras marcadas con marcadores inmunofenotípicos, lo que permite eliminar los restos de teratocarcinoma y células inmaduras. Tras el trasplante en diversas regiones del cerebro de animales de experimentación, estas neuronas no solo sobreviven, sino que también se integran en redes neuronales regionales. En animales con modelos experimentales de defectos locales del SNC, el neurotrasplante reduce las manifestaciones clínicas de patologías humanas como las consecuencias de traumatismos craneoencefálicos, accidentes cerebrovasculares, enfermedades desmielinizantes, defectos hereditarios en el desarrollo del cerebelo y enfermedades de la deposición de lípidos y polisacáridos.

Para optimizar los procesos de regeneración en enfermedades degenerativas del sistema nervioso central, se están desarrollando tecnologías para la obtención de oligodendrocitos productores de mielina a partir de células madre embrionarias (CME). La primera etapa incluye tradicionalmente la proliferación de CME con la reproducción del número de células necesario para el trasplante. En la segunda etapa, se lleva a cabo la diferenciación dirigida de células en una población de precursores de oligodendrocitos productores de mielina, controlada por antígenos marcadores selectivos.

Se abren nuevas perspectivas para el uso de derivados de células madre embrionarias (CME) en el desarrollo de métodos para corregir inmunodeficiencias causadas por defectos genéticos en la maduración del timo. En estudios con ratones knock-out (rag 1) con un defecto genético inducido (una alteración del mecanismo de recombinación de los loci V(D)J de los genes TCR, que provoca la pérdida de la función de los linfocitos T), el trasplante de derivados tempranos de CME en el timo de animales restaura la maduración de poblaciones normales de clones inmunitarios responsables de la inmunidad celular. Se están realizando ensayos clínicos de trasplante de CME preformadas in vitro para el tratamiento de anemias hereditarias mortales en niños.

Las objeciones a la rápida introducción del trasplante de células madre en la práctica clínica se basan en el número limitado de líneas estables de células madre embrionarias humanas y la necesidad de su estandarización. Para aumentar la pureza de las líneas de células madre embrionarias estandarizadas, así como de las células madre adultas humanas, se propone utilizar un método de selección de líneas basado en el análisis genético molecular de repeticiones cortas de ADN en tándem. También es necesario analizar las líneas de células madre para detectar la presencia de pequeños reordenamientos cromosómicos y mutaciones genéticas, cuya probabilidad de ocurrencia en condiciones de cultivo celular es bastante alta. Se propone la necesidad de analizar obligatoriamente las propiedades de todos los tipos de células madre embrionarias y pluripotentes regionales, ya que su reproducción in vitro puede dar lugar a la aparición de nuevas características no inherentes a las células madre embrionarias ni a los tejidos definitivos. En particular, se asume que el cultivo a largo plazo en medios con citocinas acerca las líneas de células madre a las células tumorales, ya que experimentan cambios similares en las vías de regulación del ciclo celular, adquiriendo la capacidad de realizar un número ilimitado de divisiones celulares. Algunos autores, basándose en el potencial de desarrollo tumoral, consideran imprudente el trasplante de derivados de células madre embrionarias tempranas a humanos. En su opinión, es mucho más seguro utilizar descendientes comprometidos de células madre embrionarias (CME), es decir, líneas de progenitores celulares diferenciados. Sin embargo, actualmente no se ha desarrollado una técnica fiable para obtener líneas celulares humanas estables que se diferencien en la dirección deseada.

Así, cada vez aparecen más datos en la literatura sobre el efecto terapéutico positivo del trasplante de derivados de células madre embrionarias humanas. Sin embargo, muchos de estos estudios están siendo revisados y criticados. Algunos investigadores creen que los resultados de los primeros ensayos clínicos son preliminares y solo indican que las células madre pueden ejercer un efecto favorable en la evolución clínica de una enfermedad específica. Por lo tanto, es necesario obtener datos sobre los resultados a largo plazo del trasplante celular. Las etapas de desarrollo de la neurotrasplantología clínica se citan como argumento. De hecho, al principio, predominaban en la literatura las publicaciones sobre la alta eficacia del trasplante de fragmentos cerebrales embrionarios en la enfermedad de Parkinson, pero posteriormente comenzaron a aparecer informes que negaban la eficacia terapéutica del tejido nervioso embrionario o fetal trasplantado al cerebro de pacientes.

Los primeros ensayos clínicos se realizaron para evaluar la seguridad del trasplante de neuroblastos derivados de células madre embrionarias (CME) de teratocarcinoma NTERA-2. Las células inmaduras se sometieron a proliferación en cultivo hasta alcanzar una masa celular de 100 millones. Algunas de las células así obtenidas se utilizaron para caracterizar el fenotipo y determinar impurezas celulares, así como para evaluar la posible contaminación con virus y bacterias. El LIF y la capa nutricia de las células estromales fetales se eliminaron del medio de cultivo y se crearon las condiciones para la diferenciación dirigida de las CME en neuroblastos mediante una combinación de citocinas y factores de crecimiento. Posteriormente, los neuroblastos se purificaron a partir de células inmaduras de teratocarcinoma en un separador de células de flujo. Tras la purificación secundaria y la caracterización fenotípica de las células trasplantadas, se inyectó una suspensión de neuroblastos (10-12 millones) en el núcleo basal del cerebro de los pacientes (al séptimo mes tras el ictus hemorrágico) utilizando una microcánula y una jeringa especiales bajo control estereotáxico y tomografía computarizada. El cribado anual postrasplante de las consecuencias del trasplante neuronal en la zona del ictus no reveló efectos secundarios ni indeseables. La mitad de los pacientes mostró una mejoría de la función motora entre los 6 y los 12 meses posteriores al trasplante. Los cambios clínicos positivos se acompañaron de un mayor aporte sanguíneo a la zona del ictus tras el trasplante celular: el aumento medio de la absorción de 2-desoxiglucosa marcada con fluorescencia, según la tomografía por emisión de positrones, alcanzó el 18%, y en algunos pacientes, el 35%.

Sin embargo, los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. realizaron un estudio independiente sobre la eficacia clínica del neurotrasplante en pacientes con parkinsonismo. Los pacientes del primer grupo recibieron trasplantes de tejido nervioso embrionario productor de dopamina, mientras que el segundo grupo se sometió a una cirugía simulada. Los resultados indican una eficacia clínica nula de dicho neurotrasplante, a pesar de que las neuronas embrionarias productoras de dopamina sobrevivieron en los cerebros de los receptores. Además, dos años después del trasplante de tejido nervioso embrionario, el 15 % de los pacientes desarrolló discinesia persistente, algo ausente en los pacientes del grupo placebo (Células madre: progreso científico y futuras direcciones de investigación. Instituto Nacional de Salud de EE. UU.). Se están realizando observaciones sobre la evolución de la enfermedad en estos pacientes.

Algunos autores asocian los datos contradictorios de la literatura sobre la evaluación de la eficacia clínica del neurotrasplante con diferentes enfoques para la selección de grupos de pacientes, elección inadecuada de métodos para evaluar objetivamente su condición y, lo más importante, diferentes períodos de desarrollo del tejido nervioso embrionario y diferentes áreas del cerebro de las que se obtuvo este tejido, diferentes tamaños de trasplantes y características metodológicas de la intervención quirúrgica.

Cabe destacar que los intentos de trasplante directo de células madre embrionarias pluripotentes en la región estriada del cerebro de ratas con hemiparkinsonismo experimental se acompañaron de la proliferación de células madre embrionarias (CME) y su diferenciación en neuronas dopaminérgicas. Cabe suponer que las neuronas recién formadas se integraron eficazmente en las redes neuronales, ya que tras el trasplante de CME se observó la corrección de anomalías conductuales y asimetría motora en la prueba de apomorfina. Al mismo tiempo, algunos animales fallecieron debido a la transformación de las CME trasplantadas en tumores cerebrales.

Los expertos de las Academias Nacional y Médica de los EE. UU., los especialistas del Instituto Nacional de Salud de los EE. UU. creen que el potencial clínico de las ESC merece la atención más seria, pero insisten en la necesidad de un estudio detallado de sus propiedades, la probabilidad de complicaciones y consecuencias a largo plazo en experimentos sobre modelos biológicos adecuados de enfermedades humanas (Células madre y el futuro de la medicina regenerativa National Academy Press.; Células madre y las futuras direcciones de investigación. Nat. Inst. de Salud de EE. UU.).

Desde este punto de vista, es importante que un análisis histológico comparativo de teratomas experimentales obtenidos mediante el trasplante de una suspensión de células madre embrionarias (CME) en el testículo con teratomas formados como resultado del trasplante de un embrión temprano, que también contiene CME, haya demostrado que las CME, independientemente de su origen o interacción con ciertas células circundantes, desarrollan su potencial tumorigénico de la misma manera. Se ha demostrado que estos teratomas tienen un origen clonal, ya que los tumores compuestos por derivados de las tres capas germinales pueden surgir de una sola CME (Rega, 2001). Cabe destacar que al trasplantar CME clonadas con un cariotipo normal a ratones inmunodeficientes, también se formaron teratomas compuestos por diferentes tipos de células somáticas diferenciadas. Estos datos experimentales constituyen una prueba irrefutable del origen clonal de los teratomas. Desde el punto de vista de la biología del desarrollo, indican que no son múltiples células progenitoras comprometidas, sino una única célula madre pluripotente la fuente de derivados diferenciados de las tres capas germinales que conforman un teratoma. Sin embargo, en el camino hacia el trasplante celular práctico, los resultados de estos estudios son, si no una prohibición, una señal de alerta de un peligro potencial, ya que la inoculación de células madre embrionarias (CME) o células germinales primordiales en diversos tejidos de ratones adultos inmunodeficientes provoca inevitablemente el desarrollo de tumores a partir de las células madre trasplantadas. La degeneración neoplásica de las CME trasplantadas ectópicamente se acompaña de la aparición de poblaciones satélite de células diferenciadas, debido a la diferenciación parcial de las CME y los clones progenitores en líneas especializadas. Curiosamente, cuando las CME se trasplantan a músculos esqueléticos, las neuronas se forman con mayor frecuencia junto a células de teratocarcinoma. Sin embargo, la introducción de CME en un óvulo o blastocisto en división se acompaña de una integración completa de las células en el embrión sin la formación de elementos neoplásicos. En este caso, las CME se integran en prácticamente todos los órganos y tejidos del embrión, incluido el primordio genital. Estos animales alofeno se obtuvieron inicialmente mediante la introducción de células de teratocarcinoma 129 en embriones tempranos en los estadios de 8 a 100 células. En ratones alofeno, las poblaciones de células heterogéneas derivadas de células madre embrionarias (CME) donantes se integran en los tejidos de la médula ósea, el intestino, la piel, el hígado y los genitales, lo que permite crear incluso quimeras celulares interespecies en el experimento. Cuanto más corto es el período de desarrollo del embrión temprano, mayor es el porcentaje de quimerización celular, observándose el mayor grado de quimerización en el sistema hematopoyético, la piel, el sistema nervioso, el hígado y el intestino delgado del embrión alofeno. En un organismo adulto, los tejidos protegidos del sistema inmunitario del receptor por barreras histohemáticas son susceptibles a la quimerización.El trasplante de células germinales primarias al parénquima testicular se acompaña de la incorporación de células madre del donante al tejido germinal del receptor. Sin embargo, al trasplantar células madre del donante a un blastocisto, no se produce la formación de rudimentos quiméricos de los órganos sexuales con la generación de células germinales primarias del donante. La pluripotencia de las células madre del donante, cuando se crean condiciones especiales, también puede utilizarse para la clonación: trasplantar células madre del donante a un embrión de ratón de 8 a 16 células, cuyas mitosis celulares están bloqueadas por la citocalsina, promueve la embriogénesis normal con el desarrollo de un embrión a partir de células madre del donante.

Por lo tanto, una alternativa al trasplante alogénico de células madre embrionarias (CME) es la clonación terapéutica, basada en el trasplante de núcleos de células somáticas en un óvulo enucleado para crear un blastocisto, de cuya masa celular interna se aíslan líneas de CME genéticamente idénticas al donante del núcleo somático. Técnicamente, esta idea es bastante factible, ya que la posibilidad de crear líneas de CME a partir de blastocistos obtenidos tras el trasplante de núcleos somáticos en óvulos enucleados se ha demostrado repetidamente en experimentos con animales de laboratorio (Nagy, 1990; Munsie, 2000). En particular, en ratones homocigotos para la mutación del gen rag2, se utilizaron fibroblastos obtenidos mediante el cultivo de células de tejido subepidérmico como donantes de núcleos, que se trasplantaron a ovocitos enucleados. Tras la activación del ovocito, el cigoto se cultivó hasta la formación del blastocisto, de cuya masa celular interna se aislaron células madre embrionarias (CME) y se transfirieron a una línea celular nulicigota para el gen mutante (rag2~/~). La mutación de un gen alélico se corrigió en dichas CME mediante recombinación homóloga. En la primera serie de experimentos, se obtuvieron cuerpos embrionarios de CME con un gen recombinante restaurado, sus células se transfectaron con un retrovirus recombinante (HoxB4i/GFP) y, tras la reproducción, se inyectaron en la vena de ratones rag2~/~. En la segunda serie, se agregaron blastómeros tetraploides con CME modificadas genéticamente y se trasplantaron a hembras receptoras. Los ratones inmunocompetentes resultantes sirvieron como donantes de médula ósea para el trasplante a ratones mutantes rag2~/~. En ambas series, el resultado fue positivo: tras 3-4 semanas, se encontraron células mieloides y linfoides maduras normales capaces de producir inmunoglobulinas en todos los ratones. Por lo tanto, el trasplante de núcleos de células somáticas a ovocitos puede utilizarse no solo para obtener líneas de células madre embrionarias (CME), sino también para la citogenoterapia (corrección de anomalías hereditarias), utilizando las CME como vector para el transporte de información genética correctiva. Sin embargo, esta dirección del trasplante celular, además de los problemas bioéticos, presenta limitaciones. No está claro cuán seguro será el trasplante de células clonadas terapéuticamente con un genotipo idéntico al de un paciente específico, ya que dichas células pueden introducir mutaciones que predispongan a otras enfermedades. Los óvulos humanos normales siguen siendo un objeto de difícil acceso, mientras que incluso con el trasplante de núcleos somáticos a óvulos animales enucleados, solo entre el 15% y el 25% de los "cigotos" construidos alcanzan el estadio de blastocisto. Aún no se ha determinado cuántos blastocistos se requieren para obtener una línea de CME pluripotentes clonadas. Cabe destacar también el alto nivel de costos financieros asociados a la complejidad de la metodología de clonación terapéutica.

En conclusión, cabe destacar que en las células madre embrionarias (CME), la pluripotencia del genoma con ADN hipometilado se combina con una alta actividad telomerasa y una corta fase C^ del ciclo celular, lo que asegura su reproducción intensiva y potencialmente infinita, durante la cual las CME conservan un conjunto diploide de cromosomas y un conjunto de características fenotípicas "juveniles". El crecimiento clonal de las CME en cultivo no interfiere con su diferenciación en ninguna línea celular especializada del organismo cuando se detiene la proliferación y se añaden las señales reguladoras adecuadas. La diferenciación por restricción de las CME en líneas celulares somáticas in vitro se realiza sin la participación del mesénquima, sin pasar por el Nochteys, fuera de la organogénesis y sin formación de embriones. La introducción ectópica de CME in vivo conduce inevitablemente a la formación de teratocarcinomas. El trasplante de CME a un blastocisto o embrión temprano se acompaña de su integración con los tejidos embrionarios y la quimerización estable de sus órganos.

Las tecnologías regenerativas-plásticas basadas en el trasplante celular son el punto de encuentro de intereses de representantes de la biología celular, la biología del desarrollo, la genética experimental, la inmunología, la neurología, la cardiología, la hematología y muchas otras ramas de la medicina experimental y práctica. Los resultados más importantes de estudios experimentales demuestran la posibilidad de reprogramar células madre mediante una modificación específica de sus propiedades, lo que abre la posibilidad de controlar los procesos de citodiferenciación mediante factores de crecimiento para la regeneración miocárdica, la reparación de lesiones del SNC y la normalización de la función del aparato de los islotes pancreáticos. Sin embargo, para la introducción generalizada del trasplante de derivados de células madre embrionarias (CME) en la medicina práctica, es necesario estudiar con mayor detalle las propiedades de las células madre humanas y continuar los experimentos con CME en modelos experimentales de enfermedades.

Las cuestiones bioéticas y el problema del rechazo de un trasplante alogénico de células podrían resolverse mediante el descubrimiento de la plasticidad del genoma de las células madre regionales de un organismo adulto. Sin embargo, la información inicial que indicaba que, al trasplantar células hematopoyéticas autólogas aisladas y cuidadosamente caracterizadas al hígado, de las cuales se derivan nuevos hepatocitos, se integran en los lobulillos hepáticos, está siendo revisada y criticada. No obstante, se han publicado datos que indican que el trasplante de células madre neurales al timo provoca la formación de nuevos brotes de linfocitos T y B del donante, y el trasplante de células madre neurales cerebrales a la médula ósea conduce a la formación de brotes hematopoyéticos con mielo y eritropoyesis del donante a largo plazo. En consecuencia, las células madre pluripotentes capaces de reprogramar el genoma al potencial de las células madre embrionarias (CME) pueden persistir en los órganos de un organismo adulto.

La fuente de obtención de células madre embrionarias (CME) con fines médicos sigue siendo el embrión humano, lo que predetermina la inevitabilidad de una nueva intersección de cuestiones morales, éticas, legales y religiosas en el origen de la vida humana. El descubrimiento de las CME ha impulsado con fuerza la reanudación de arduos debates sobre la frontera entre las células vivas y la materia, el ser y la personalidad. Al mismo tiempo, no existen normas, reglas ni leyes universales respecto al uso de las CME en medicina, a pesar de los repetidos intentos de crearlas y adoptarlas. Cada estado, en el marco de su legislación, resuelve este problema de forma independiente. Por su parte, médicos de todo el mundo siguen intentando llevar la medicina regenerativa-plástica más allá de estos debates, principalmente mediante el uso de reservas de células madre adultas en lugar de células madre embrionarias.

Un poco de historia del aislamiento de células madre embrionarias

Se aislaron células de teratocarcinoma (embrionario) de teratomas testiculares espontáneos de ratones 129/ter-Sv, teratomas ováricos espontáneos de ratones Lt/Sv y teratomas derivados de células o tejidos embrionarios trasplantados ectópicamente. Entre las líneas celulares estables de teratocarcinoma (embrionario) murino obtenidas de esta manera, algunas eran pluripotentes, otras se diferenciaban solo en un tipo celular específico y algunas eran completamente incapaces de citodiferenciación.

En un momento dado, la atención se centró en los estudios cuyos resultados indicaban la posibilidad de devolver las células de terato-(embrionario)-carcinoma a un fenotipo normal después de su introducción en los tejidos de un embrión en desarrollo, así como en el trabajo sobre la creación in vitro de células de terato-(embrionario)-carcinoma modificadas genéticamente, con cuya ayuda se obtuvieron ratones mutantes para el modelado biológico de la patología hereditaria humana.

Se utilizó el cultivo en suspensión condicionada para aislar líneas celulares de carcinoma de teratoembrionario. En cultivo, las células de carcinoma de teratoembrionario, al igual que las células madre embrionarias (CME), crecen para formar cuerpos embrionarios y requieren una disociación obligatoria para la transferencia de línea, manteniendo así la pluripotencia en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios o durante el cultivo en suspensión en un medio acondicionado. Las células de las líneas pluripotentes de carcinoma de teratoembrionario son grandes, esféricas, se caracterizan por una alta actividad de fosfatasa alcalina, forman agregados y son capaces de diferenciación multidireccional. Al introducirse en un blastocisto, se agregan con la mórula, lo que conduce a la formación de embriones quiméricos, en la composición de diversos órganos y tejidos de los cuales se encuentran derivados de células de carcinoma de teratoembrionario. Sin embargo, la gran mayoría de estos embriones quiméricos mueren in utero, y en los órganos de las quimeras recién nacidas supervivientes, las células extrañas se detectan raramente y en baja densidad. Al mismo tiempo, la incidencia de tumores (fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, otros tipos de tumores malignos y adenoma pancreático) aumenta drásticamente y la degeneración tumoral a menudo ocurre durante el período de desarrollo intrauterino de los embriones quiméricos.

La mayoría de las células de teratocarcinoma (embrionario) en el microambiente de las células embrionarias normales adquieren características neoplásicas malignas de forma casi natural. Se cree que la malignidad irreversible se debe a la activación de protooncogenes en el proceso de reordenamientos estructurales. Una de las excepciones son las células de la línea de embriocarcinoma SST3, obtenidas de teratomas testiculares de ratón (línea 129/Sv-ter), que muestran una alta capacidad de integración en los tejidos y órganos del embrión sin formación posterior de tumores en ratones quiméricos. Los derivados de las líneas celulares de teratocarcinoma (embrionario) en ratones quiméricos prácticamente no participan en la formación de gonocitos primarios. Aparentemente, esto se debe a la alta frecuencia de aberraciones cromosómicas características de la mayoría de las líneas de teratocarcinoma (embrionario), en cuyas células se observan tanto aneuploidía como anomalías cromosómicas.

Se obtuvieron en condiciones de laboratorio varias líneas estables de células de teratocarcinoma (embrionario) humano, caracterizadas por pluripotencia, alta actividad proliferativa y capacidad de diferenciación durante el crecimiento en cultivos. En particular, la línea de células de teratocarcinoma (embrionario) humano NTERA-2 se utilizó para estudiar los mecanismos de citodiferenciación neuronal. Tras el trasplante de células de esta línea en la región subventricular del prosencéfalo de ratas recién nacidas, se observó su migración y neurogénesis. Incluso se intentó trasplantar neuronas obtenidas mediante cultivo de células de la línea de teratocarcinoma (embrionario) NTERA-2 a pacientes con ictus, lo que, según los autores, condujo a una mejoría en la evolución clínica de la enfermedad. Al mismo tiempo, no se registraron casos de malignidad de células trasplantadas de la línea de teratocarcinoma (embrionario) NTERA-2 en pacientes con ictus.

Las primeras líneas de células madre embrionarias de ratón pluripotentes indiferenciadas fueron obtenidas a principios de la década de 1980 por Evans y Martin, quienes las aislaron de la masa celular interna del blastocisto (el embrioblasto). Las líneas de células madre embrionarias aisladas conservaron la pluripotencia y la capacidad de diferenciarse en diversos tipos celulares bajo la influencia de factores en un medio de cultivo especial durante mucho tiempo.

El término "célula madre pluripotente embrionaria" pertenece a Leroy Stevens, quien, al estudiar el efecto del alquitrán de tabaco en la incidencia del desarrollo tumoral, llamó la atención sobre la aparición espontánea de teratocarcinoma testicular en ratones lineales (129/v) del grupo control. Las células de teratocarcinomas testiculares se caracterizaron por una alta tasa de proliferación y, en presencia de líquido de la cavidad abdominal, se diferenciaron espontáneamente con la formación de neuronas, queratinocitos, condrocitos, cardiomiocitos, así como fragmentos de pelo y hueso, pero sin ningún signo de citoarquitectura ordenada del tejido correspondiente. Al colocarlas en cultivo, las células de teratocarcinoma crecieron como clones pluripotentes no unidos al sustrato y formaron cuerpos embrionarios, después de lo cual dejaron de dividirse y experimentaron una diferenciación desordenada espontánea en neuronas, glía, células musculares y cardiomiocitos. Stevens descubrió que el teratocarcinoma de ratón 129/v contiene menos del 1% de células capaces de diferenciarse en diversas líneas somáticas especializadas, y que la propia diferenciación depende de los factores que las afectan (la composición del líquido peritoneal, los productos de células maduras o los tejidos añadidos al cultivo). La hipótesis de Leroy Stevenson sobre la presencia de células progenitoras embrionarias de la línea germinal entre las células de teratocarcinoma se confirmó: una suspensión de células embrioblásticas de embriones preimplantacionales en tejidos de ratones adultos formó teratocarcinomas, y las líneas celulares puras aisladas de ellos, tras la administración intraperitoneal a animales receptores, se diferenciaron en neuronas, cardiomiocitos y otras células somáticas derivadas de las tres capas germinales. En experimentos in vivo, el trasplante de células madre embrionarias (obtenidas del embrioblasto, pero no del trofoblasto) a embriones de ratón de otra línea en los estadios de blastómero 8-32 resultó en el nacimiento de animales quiméricos (sin desarrollo de tumores), en cuyos órganos se encontraron brotes de tejido donante. Se observó quimerismo incluso en la línea de células germinales.

Las células germinales progenitoras primarias aisladas del rudimento genital de un embrión de ratón se correspondieron en morfología, fenotipo inmunológico y características funcionales con las células madre embrionarias (CME) obtenidas por Stevenson de teratocarcinoma y embrioblasto. En las quimeras nacidas tras la introducción de CME en un blastocisto, la morfogénesis de los órganos por alofeno se caracterizó por una alternancia en mosaico de unidades estructurales y funcionales del donante y el receptor del hígado, los pulmones y los riñones. En algunos casos, se observó la formación de criptas intestinales o lóbulos hepáticos compuestos por células tanto del receptor como del donante. Sin embargo, la morfogénesis siempre se realizó de acuerdo con el programa genético de la especie a la que pertenecía el receptor, y el quimerismo se limitó exclusivamente al nivel celular.

Se estableció entonces que la proliferación de células madre embrionarias sin citodiferenciación en una capa alimentadora de células derivadas del mesénquima (fibroblastos fetales) ocurre con la presencia obligatoria de LIF en medios nutritivos selectivos, que aseguran selectivamente la supervivencia únicamente de células madre y progenitoras, mientras que la abrumadora mayoría de elementos celulares especializados mueren. Utilizando estos métodos, en 1998, James Thomson aisló cinco líneas inmortalizadas de células madre embrionarias de la masa celular interna de un blastocisto humano. Ese mismo año, John Gerhart desarrolló un método para aislar líneas inmortales de células madre embrionarias del tubérculo genital de embriones humanos de cuatro a cinco semanas de edad. Debido a sus propiedades únicas, solo dos años después, las células madre embrionarias y las células madre de tejidos definitivos comenzaron a utilizarse en la práctica de la medicina regenerativa y la terapia génica.