Células madre y medicina plástica regenerativa

Hoy en día, son pocos los médicos en ejercicio que desconocen el desarrollo de una nueva dirección en el tratamiento de las enfermedades más graves, previamente incurables mediante la medicina tradicional y alternativa. Se trata de la medicina regenerativa-plástica, basada en el uso del potencial regenerativo de las células madre. En torno a esta nueva dirección, se ha generado un debate científico sin precedentes y un revuelo pseudocientífico, generado en gran medida gracias a la hiperbolización informativa de la World Wide Web. En muy poco tiempo, los estudios de laboratorio sobre las capacidades terapéuticas de las células madre han trascendido el ámbito experimental y se han comenzado a introducir activamente en la medicina práctica, lo que ha generado numerosos problemas de carácter científico, ético, religioso, legal y legislativo. Las instituciones estatales y públicas han demostrado claramente no estar preparadas para la rápida transición de las células madre de las placas de Petri a los sistemas de administración intravenosa, lo cual no beneficia ni a la sociedad en su conjunto ni a la persona afectada en particular. No es fácil comprender la inimaginable cantidad de información sobre las capacidades de las células madre, tanto en cantidad como en calidad, incluso para los especialistas (de los cuales no hay ninguno, ya que cada uno intenta dominar la nueva tendencia científica por su cuenta), por no hablar de los médicos que no están directamente involucrados en la medicina plástica regenerativa.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

¿Por qué son necesarios estos experimentos y son realmente necesarios?

A primera vista, la creación de quimeras celulares interespecies es fruto de la fantasía desenfrenada de un científico fanático que ha olvidado la bioética. Sin embargo, este enfoque ha ampliado significativamente nuestro conocimiento fundamental de la embriogénesis, ya que ha permitido calcular el número de células necesarias para la organogénesis (la formación del hígado, el cerebro, la piel y los órganos del sistema inmunitario). Además (quizás este sea el aspecto más importante de la biología de las ESC), los genetistas han obtenido una herramienta única que permite determinar la función de los genes durante la quimerización de embriones. Primero, se utiliza una técnica especial de doble knockout para desactivar el par de genes estudiado en las ESC. A continuación, estas ESC se introducen en un blastocisto y se monitorizan los cambios que se producen en el cuerpo del embrión quimérico en desarrollo. De esta manera, se establecieron las funciones de los genes sf-1 (desarrollo de la glándula suprarrenal y los órganos genitales), urt-l (desarrollo renal), muoD (desarrollo del músculo esquelético) y gata-l-4 (desarrollo de la eritropoyesis y la linfopoyesis). Además, se pueden introducir (transfectar) genes humanos aún no estudiados en células madre embrionarias (CME) de animales de laboratorio para determinar su función mediante un embrión quimérico.

Pero, por lo general, justificar un experimento mediante la obtención de nuevos conocimientos fundamentales no suele contar con el apoyo de un público amplio. Pongamos un ejemplo de la importancia práctica de la quimerización mediante células madre embrionarias (CME). En primer lugar, se trata del xenotrasplante, es decir, el trasplante de órganos animales a humanos. En teoría, la creación de quimeras celulares humanas-cerdas permite obtener un animal con características antigénicas mucho más cercanas a las del donante de CME, lo que en diversas situaciones clínicas (diabetes mellitus, cirrosis hepática) puede salvar la vida de una persona enferma. Es cierto que para ello primero debemos aprender a devolver la totipotencia al genoma de una célula somática madura, tras lo cual puede introducirse en un embrión de cerdo en desarrollo.

Hoy en día, la capacidad de las células madre embrionarias (CME) de dividirse casi infinitamente en condiciones especiales de cultivo se utiliza para producir una masa celular totipotente, con su posterior diferenciación en células especializadas, como neuronas dopaminérgicas, que posteriormente se trasplantan a un paciente con enfermedad de Parkinson. En este caso, el trasplante va precedido necesariamente de una diferenciación dirigida de la masa celular obtenida en células especializadas, necesarias para el tratamiento y la purificación de estas últimas a partir de elementos celulares indiferenciados.

Como se descubrió posteriormente, la amenaza de carcinogénesis no era el único obstáculo para el trasplante celular. Espontáneamente, las células madre embrionarias (CME) en los cuerpos embrionarios se diferencian de forma heterogénea, es decir, forman derivados de una amplia variedad de líneas celulares (neuronas, queratinocitos, fibroblastos, endoteliocitos). En el campo de visión del microscopio, en este caso, los cardiomiocitos destacan entre las células de diversos fenotipos, cada uno de los cuales se contrae a su propio ritmo. Sin embargo, para tratar a un paciente, es necesario contar con poblaciones celulares puras: neuronas en caso de ictus, cardiomiocitos en caso de infarto de miocardio, células β del páncreas en caso de diabetes mellitus, queratinocitos en caso de quemaduras, etc.

La siguiente etapa en el desarrollo de la transplantología celular se asoció con el desarrollo de tecnologías para obtener una cantidad suficiente (millones de células) de dichas poblaciones celulares puras. La búsqueda de factores que causaran la diferenciación dirigida de las ESC fue de naturaleza empírica, ya que la secuencia de su síntesis durante la embriogénesis seguía siendo desconocida. Al principio, se estableció que la formación del saco vitelino se induce añadiendo AMPc y ácido retinoico al cultivo de ESC. Las líneas celulares hematopoyéticas se formaron en presencia de 1L-3, SCF, factor de crecimiento de fibroblastos (FGH), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), 1L-6 y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-СSF) en el medio de cultivo. Las células del sistema nervioso se formaron a partir de las ESC tras la eliminación de LIF y la capa de fibroblastos, que sirvió como alimentador. Tras el tratamiento con ácido retinoico en presencia de suero fetal, las células madre embrionarias (CME) comenzaron a diferenciarse en neuronas, y se obtuvieron cardiomiocitos mediante la adición de dimetilsulfóxido (DMSO), que proporciona la administración dirigida de moléculas de señalización hidrofóbica al núcleo celular. En este caso, la acumulación de especies activas de oxígeno en el medio de cultivo, así como la estimulación eléctrica, contribuyeron a la formación de cardiomiocitos contráctiles maduros.

Se invirtieron enormes esfuerzos y recursos en encontrar las condiciones para la diferenciación de las células madre embrionarias (CME) en células productoras de insulina del páncreas. Sin embargo, pronto se hizo evidente que varias líneas celulares especializadas (células β pancreáticas, células inmunitarias y endocrinas, adipocitos) no surgen de las CME cuando se estimulan según el principio de "un factor estimulante - una línea celular". Este principio resultó ser válido solo para un número limitado de líneas celulares. En particular, la formación de neuronas puede ser inducida por ácido retinoico, la línea celular muscular por factor de crecimiento transformante β (TCP-β), las líneas eritroides por 1L-6 y la línea monocítico-mieloide por 1L-3. Además, los efectos de estos factores en la diferenciación de las CME resultaron ser estrictamente dependientes de la dosis.

Comenzó la etapa de búsqueda de combinaciones de factores de crecimiento que impulsaran a las células madre embrionarias (CME) a etapas posteriores de la embriogénesis, con la formación del mesodermo (fuente de cardiomiocitos, músculos esqueléticos, epitelio del túbulo renal, mieloeritropoyesis y células musculares lisas), ectodermo (epidermis, neuronas, retina) y endodermo (epitelio del intestino delgado y glándulas secretoras, neumocitos). La naturaleza parecía obligar a los investigadores a avanzar por el camino de la embriogénesis, repitiendo sus etapas en una placa de Petri, impidiendo obtener de forma inmediata y sencilla el resultado deseado. Y se encontraron tales combinaciones de factores de crecimiento. La activina A en combinación con TGF-β resultó ser un potente estimulador de la formación de células mesodérmicas a partir de CME, al tiempo que bloqueaba el desarrollo del endodermo y el ectodermo. El ácido retinoico y una combinación de señales de la proteína morfogenética de la médula ósea (BMP-4) y del factor de crecimiento epidérmico (EGF) activan la formación de células del ectodermo y del mesodermo, deteniendo así el desarrollo del endodermo. Se observa un crecimiento celular intensivo de las tres capas germinales gracias al efecto simultáneo de dos factores sobre las células madre embrionarias (CME): el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y el factor de crecimiento de células nerviosas.

Por lo tanto, para obtener las líneas celulares necesarias, es necesario primero transferir células madre embrionarias a la etapa de formación de células de alguna capa germinal y, posteriormente, seleccionar una nueva combinación de factores de crecimiento capaz de inducir la diferenciación dirigida del ectodermo, mesodermo y endodermo en células especializadas necesarias para el trasplante al paciente. Actualmente, existen miles de combinaciones de factores de crecimiento, la mayoría patentadas, y algunas no han sido divulgadas por las empresas biotecnológicas.

Era hora de purificar las células obtenidas de impurezas celulares indiferenciadas. Las células diferenciadas en el cultivo se marcaron con marcadores de líneas celulares maduras y se pasaron a través de un clasificador inmunofenotípico láser de alta velocidad. El rayo láser las encontró en el flujo celular general y las dirigió por una ruta separada. Los animales de laboratorio fueron los primeros en recibir el material celular purificado obtenido. Era hora de evaluar la efectividad del uso de derivados de ESC en modelos de enfermedades y procesos patológicos. Uno de estos modelos era la enfermedad de Parkinson experimental, que se reproduce bien en animales utilizando compuestos químicos que destruyen las neuronas dopaminérgicas. Dado que la enfermedad en humanos se basa en una deficiencia adquirida de neuronas dopaminérgicas, el uso de la terapia celular de reemplazo en este caso estaba justificado patogénicamente. En animales con hemiparkinsonismo experimental, aproximadamente la mitad de las neuronas dopaminérgicas obtenidas de ESC e introducidas en las estructuras cerebrales se arraigaron. Esto fue suficiente para reducir significativamente las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Los intentos de restaurar la función de las estructuras del SNC dañadas en accidentes cerebrovasculares experimentales, lesiones e incluso rupturas de la médula espinal han demostrado ser bastante exitosos.

Sin embargo, cabe señalar que casi todos los casos de uso exitoso de derivados de ESC diferenciados para la corrección de la patología experimental se llevaron a cabo en el período agudo de la situación patológica simulada. Los resultados del tratamiento a distancia no fueron tan alentadores: después de 8-16 meses, el efecto positivo del trasplante celular desapareció o disminuyó drásticamente. Las razones para esto son bastante claras. La diferenciación de las células trasplantadas in vitro o in loco morbi conduce inevitablemente a la expresión de marcadores celulares de foránea genética, lo que provoca un ataque inmunológico del cuerpo del receptor. Para resolver el problema de la incompatibilidad inmunológica, se utilizó la inmunosupresión tradicional, paralelamente a la cual los ensayos clínicos comenzaron a comprender el potencial de la transdiferenciación y la corrección genética de células madre hematopoyéticas y mesenquimales autólogas que no causan un conflicto inmunológico.

¿Qué es la medicina plástica regenerativa?

La evolución ha determinado dos opciones principales para el fin de la vida celular: la necrosis y la apoptosis, que a nivel tisular corresponden a los procesos de proliferación y regeneración. La proliferación puede considerarse una especie de sacrificio, cuando el tejido dañado se rellena mediante su reemplazo con elementos de tejido conectivo: manteniendo la integridad estructural, el cuerpo pierde parcialmente la función del órgano afectado, lo que determina el desarrollo posterior de reacciones compensatorias con hipertrofia o hiperplasia de los elementos estructurales y funcionales que permanecen intactos. La duración del período de compensación depende del volumen de las lesiones estructurales causadas por los factores de alteración primaria y secundaria, tras lo cual, en la gran mayoría de los casos, se produce una descompensación, un deterioro agudo de la calidad y una reducción de la duración de la vida humana. La regeneración fisiológica asegura los procesos de remodelación, es decir, la sustitución de células envejecidas y moribundas por mecanismos de muerte celular natural (apoptosis) por células nuevas provenientes de las reservas de células madre del cuerpo humano. Los procesos de regeneración reparativa también involucran los recursos celulares de los espacios troncales, los cuales, sin embargo, se movilizan en condiciones patológicas asociadas a enfermedad o daño tisular, iniciando la muerte celular a través de mecanismos de necrosis.

La gran atención que científicos, médicos, la prensa, la televisión y el público general prestan al estudio de la biología de las células madre embrionarias (CME) se debe, en primer lugar, al gran potencial de la terapia celular o, como la llamamos, terapia regenerativa-plástica. El desarrollo de métodos para tratar las enfermedades humanas más graves (patología degenerativa del sistema nervioso central, lesiones medulares y cerebrales, Alzheimer y Parkinson, esclerosis múltiple, infarto de miocardio, hipertensión arterial, diabetes mellitus, enfermedades autoinmunes y leucemia, quemaduras y procesos neoplásicos, entre otras) se basa en las propiedades únicas de las células madre, que permiten la creación de nuevos tejidos para reemplazar, como se creía anteriormente, áreas de tejido irreversiblemente dañadas de un organismo enfermo.

El progreso de la investigación teórica en biología de células madre durante los últimos 10 años se ha materializado en áreas emergentes de la medicina regenerativa-plástica, cuya metodología no solo es fácil de sistematizar, sino que también la requiere. El primer campo, y el de mayor desarrollo, en el uso práctico del potencial regenerativo de las células madre ha sido la terapia regenerativa-plástica de reemplazo. Su trayectoria se puede rastrear fácilmente en la literatura científica, desde experimentos con animales con necrosis miocárdica hasta los trabajos de los últimos años destinados a restaurar la deficiencia de cardiomiocitos tras un infarto o reponer la pérdida de células β pancreáticas y neuronas dopaminérgicas del sistema nervioso central.

Trasplante de células

La base de la medicina regenerativa-plástica sustitutiva es el trasplante celular. Este último debe definirse como un conjunto de medidas médicas, durante las cuales el cuerpo del paciente tiene contacto directo con células viables de origen autogénico, alogénico, isogénico o xenogénico, durante un período corto o largo. El método de trasplante celular es una suspensión de células madre o sus derivados, estandarizada por el número de unidades de trasplante. Una unidad de trasplante es la relación entre el número de unidades formadoras de colonias en el cultivo y el número total de células trasplantadas. Métodos de trasplante celular: administración intravenosa, intraperitoneal y subcutánea de una suspensión de células madre o sus derivados; administración de una suspensión de células madre o sus derivados en los ventrículos cerebrales, los vasos linfáticos o el líquido cefalorraquídeo.

El trasplante alogénico y autólogo de células emplea dos enfoques metodológicos fundamentalmente diferentes para la implementación del potencial pluripotente, multipotente o polipotente de las células madre: in vivo o in vitro. En el primer caso, la introducción de células madre en el cuerpo del paciente se lleva a cabo sin su diferenciación preliminar; en el segundo, tras la reproducción en cultivo, la diferenciación dirigida y la purificación de elementos indiferenciados. Entre las numerosas técnicas metodológicas de la terapia celular de reemplazo, se distinguen claramente tres grupos de métodos: reemplazo de médula ósea y células sanguíneas, reemplazo de células de órganos y tejidos blandos, y reemplazo de elementos rígidos y sólidos del cuerpo (cartílago, hueso, tendones, válvulas cardíacas y vasos capacitivos). Esta última dirección debe definirse como medicina reconstructiva y regenerativa, ya que el potencial de diferenciación de las células madre se realiza en una matriz: una estructura biológicamente inerte o absorbible con la forma del área reemplazada del cuerpo.

Otra forma de aumentar la intensidad de los procesos regenerativos-plásticos en los tejidos dañados es movilizar los recursos de células madre del propio paciente mediante el uso de factores de crecimiento exógenos, como los factores estimulantes de colonias de granulocitos y macrófagos. En este caso, la ruptura de las conexiones estromales provoca un aumento en la liberación de células madre hematopoyéticas al torrente sanguíneo general, que, en la zona dañada del tejido, propician procesos de regeneración gracias a su plasticidad inherente.

Así, los métodos de medicina regenerativa tienen como objetivo estimular los procesos de restauración de la función perdida, ya sea mediante la movilización de las propias reservas de células madre del paciente o mediante la introducción de material celular alogénico.

Un importante resultado práctico del descubrimiento de las células madre embrionarias es la clonación terapéutica, basada en la comprensión de los desencadenantes de la embriogénesis. Si la señal inicial para el inicio de la embriogénesis es el complejo pre-ARNm ubicado en el citoplasma del ovocito, la introducción del núcleo de cualquier célula somática en el óvulo enucleado debería desencadenar el programa de desarrollo embrionario. Hoy en día, ya sabemos que alrededor de 15.000 genes participan en la implementación del programa de embriogénesis. ¿Qué sucede con ellos posteriormente, tras el nacimiento, durante los períodos de crecimiento, madurez y envejecimiento? La oveja Dolly dio la respuesta: se conservan. Utilizando los métodos de investigación más modernos, se ha demostrado que los núcleos de las células adultas conservan todos los códigos necesarios para la formación de células madre embrionarias, las capas germinales, la organogénesis y la maduración por restricción (salida a la diferenciación y especialización) de líneas celulares de origen mesenquimal, ecto, endo y mesodérmico. La clonación terapéutica como dirección se formó ya en las primeras etapas del desarrollo de la transplantología celular y prevé la devolución de la totipotencia a las propias células somáticas del paciente para obtener material de transplante genéticamente idéntico.

El descubrimiento de las células madre comenzó "desde el final", ya que el término introducido en biología y medicina por A. Maksimov se refería a las células madre de la médula ósea, que dan origen a todos los elementos celulares maduros de la sangre periférica. Sin embargo, las células madre hematopoyéticas, como las células de todos los tejidos de un organismo adulto, también tienen su propio predecesor menos diferenciado. La fuente común para absolutamente todas las células somáticas es la célula madre embrionaria. Cabe señalar que los conceptos de "células madre embrionarias" y "células madre embrionarias" no son en absoluto idénticos. Las células madre embrionarias fueron aisladas por J. Thomson de la masa celular interna del blastocisto y transferidas a líneas celulares de larga vida. Solo estas células tienen un facsímil de "CME". Leroy Stevens, quien descubrió las células madre embrionarias en experimentos con ratones, las denominó "células madre pluripotentes embrionarias", refiriéndose a la capacidad de las CME de diferenciarse en derivados de las tres capas germinales (ecto, meso y endodermo). Sin embargo, todas las células del embrión en etapas posteriores de desarrollo también son células madre, ya que dan origen a una gran cantidad de células que forman el cuerpo de un adulto. Para definirlas, proponemos el término «células progenitoras pluripotentes embrionarias».

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Tipos de células madre

La clasificación moderna de las células madre se basa en el principio de su división por su capacidad (potencia) para dar lugar a líneas celulares, que se define como toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- y unipotencia. La totipotencia, es decir, la capacidad de recrear un organismo genéticamente programado como un todo, la poseen las células cigotas, los blastómeros y las células madre embrionarias (células de la masa interna del blastocisto). Otro grupo de células totipotentes, que se forman en etapas posteriores del desarrollo embrionario, está representado por las células germinales primarias de la zona genital embrionaria (tubérculos genitales). La pluripotencia, que es la capacidad de diferenciarse en células de cualquier órgano o tejido, es inherente a las células embrionarias de las tres capas germinales: ecto-, meso- y endodermo. Se cree que la multipotencia, es decir, la capacidad de formar cualquier célula dentro de una línea especializada, es característica de solo dos tipos de células: las llamadas células madre mesenquimales, que se forman en la cresta neural y son las precursoras de todas las células de la base del tejido conectivo del cuerpo, incluidas las células de la neuroglia, así como las células madre hematopoyéticas, que dan lugar a todas las líneas celulares sanguíneas. Además, se distinguen células madre bipotentes y unipotentes, en particular, las células precursoras de los brotes hematopoyéticos mieloides, linfoides, monocíticos y megacariocíticos. La existencia de células madre unipotentes se ha demostrado claramente utilizando el ejemplo de las células hepáticas: la pérdida de una parte significativa del tejido hepático se compensa con la división intensiva de los hepatocitos poliploides diferenciados.

Durante el desarrollo, todos los órganos y tejidos se forman como resultado de la proliferación y diferenciación de la masa celular interna del blastocisto, cuyas células son, en sentido estricto, células madre embrionarias totipotentes. El primer trabajo sobre el aislamiento de células madre embrionarias fue realizado por Evans, quien demostró que los blastocistos implantados en el cerebro de ratones dan lugar a teratocarcinomas, cuyas células, al clonarse, forman líneas de células madre embrionarias pluripotentes (el nombre original de estas células, células de carcinoma embrionario o en su abreviatura ECС, actualmente no se utiliza). Estos datos fueron confirmados en varios otros estudios en los que se obtuvieron células madre embrionarias mediante el cultivo de células de blastocisto de ratones y otras especies animales, así como de humanos.

En los últimos años, la literatura ha reportado cada vez más sobre la plasticidad de las células madre, considerada no solo como la capacidad de estas para diferenciarse en diferentes tipos de células en distintas etapas de desarrollo, sino también para experimentar desdiferenciación (transdiferenciación, retrodiferenciación). Es decir, se admite la posibilidad fundamental de que una célula somática diferenciada regrese a la etapa de desarrollo embrionario con recapitulación (retorno) de la pluripotencia y su implementación en la diferenciación repetida con la formación de células de un tipo diferente. En particular, se reporta que las células madre hematopoyéticas son capaces de transdiferenciarse con la formación de hepatocitos, cardiomioblastos y endoteliocitos.

Los debates científicos respecto a la división de las células madre según su plasticidad continúan, es decir, la terminología y el glosario del trasplante celular están en proceso de formación, lo que tiene un significado práctico directo, ya que la mayoría de los métodos de medicina plástica regenerativa se basan en el uso de las propiedades plásticas y la capacidad de las células madre para diferenciarse en varias líneas celulares.

El número de publicaciones en el campo de los problemas fundamentales y aplicados de la medicina regenerativa-plástica está en rápido aumento. Ya se ha descrito una gama de enfoques metodológicos para optimizar el uso del potencial regenerativo-plástico de las células madre. Cardiólogos, endocrinólogos, neurólogos, neurocirujanos, trasplantólogos y hematólogos han identificado sus áreas de interés urgente. Oftalmólogos, tisiólogos, neumólogos, nefrólogos, oncólogos, genetistas, pediatras, gastroenterólogos, terapeutas, cirujanos y ginecólogos-obstetras buscan una solución a los problemas urgentes relacionados con las capacidades plásticas de las células madre; todos los representantes de la medicina moderna esperan tener la oportunidad de curar enfermedades que antes se consideraban mortales.

¿Es el trasplante de células la próxima “panacea”?

Esta pregunta se plantea, con razón, a todos los médicos y científicos reflexivos que analizan el estado actual de la ciencia médica. La situación se complica por el hecho de que, en un lado del campo de la confrontación científica, se encuentran los "conservadores sanos" y, en el otro, los "fanáticos enfermizos" de la transplantología celular. Obviamente, la verdad, como siempre, se encuentra entre ellos, en "tierra de nadie". Sin entrar en cuestiones de derecho, ética, religión y moral, consideremos los pros y los contras de las áreas designadas de la medicina regenerativa-plástica. La "ligera brisa" de los primeros informes científicos sobre las posibilidades terapéuticas de las células madre embrionarias (CME) se convirtió en un "viento racheado" un año después de su descubrimiento, que se convirtió en un "tornado de información" en 2003. La primera serie de publicaciones abordó los temas del cultivo de células madre embrionarias, su reproducción y la diferenciación dirigida in vitro.

Resultó que para la reproducción ilimitada de células madre embrionarias en cultivo es necesario observar estrictamente una serie de condiciones. Tres factores deben estar presentes en el medio acondicionado: interleucina-6 (IL-6), factor de células madre (SCF) y factor inhibidor de la leucasa (LIF). Además, las células madre embrionarias deben cultivarse en un sustrato (capa alimentadora de células) de fibroblastos embrionarios y en presencia de suero bovino fetal. Si se cumplen estas condiciones, las ESC en cultivo crecen como clones y forman cuerpos embrionarios: agregados de clones en suspensión de células esféricas. La característica más importante del clon de ESC es que en cultivo, el cuerpo embrionario deja de crecer cuando se acumulan 50-60, máximo 100 células en el agregado. Durante este período, se produce un estado de equilibrio: la tasa de división celular dentro del clon es igual a la tasa de apoptosis (muerte celular programada) en su periferia. Tras alcanzar dicho equilibrio dinámico, las células periféricas del cuerpo embrionario experimentan una diferenciación espontánea (generalmente con la formación de fragmentos endodérmicos del saco vitelino, angioblastos y endoteliocitos), con pérdida de totipotencia. Por lo tanto, para obtener una cantidad suficiente de masa celular totipotente, el cuerpo embrionario debe desagregarse semanalmente mediante el trasplante de células madre embrionarias individuales a un nuevo medio nutritivo, un proceso bastante laborioso.

El descubrimiento de las células madre embrionarias no respondió a la pregunta de qué exactamente y cómo desencadena los programas de embriogénesis cifrados en el ADN del cigoto. Sigue sin estar claro cómo se despliega el programa genómico durante la vida humana. Al mismo tiempo, el estudio de las células madre embrionarias permitió desarrollar un concepto de los mecanismos para mantener la totipotencia, pluripotencia y multipotencia de las células madre durante su división. La principal característica distintiva de una célula madre es su capacidad de autorreproducirse. Esto significa que una célula madre, a diferencia de una célula diferenciada, se divide asimétricamente: una de las células hijas da lugar a una línea celular especializada, y la segunda conserva la totipotencia, pluripotencia o multipotencia del genoma. Sigue sin estar claro por qué y cómo ocurre este proceso en las primeras etapas de la embriogénesis, cuando la masa celular interna en división del blastocisto es completamente totipotente, y el genoma de la célula madre embrionaria se encuentra en un estado latente (dormido, inhibido). Si durante la división de una célula ordinaria el proceso de duplicación es necesariamente precedido por la activación y expresión de un complejo completo de genes, entonces durante la división de ESC esto no sucede. La respuesta a la pregunta "por qué" se obtuvo después del descubrimiento de ARNm preexistente (pre-ARNm) en ESC, algunos de los cuales se forman en células foliculares y se almacenan en el citoplasma del óvulo y el cigoto. El segundo descubrimiento respondió a la pregunta "cómo": enzimas especiales llamadas "editasas" se encontraron en ESC. Las editasas realizan tres funciones importantes. En primer lugar, proporcionan lectura y duplicación epigenética alternativa (sin participación del genoma) del pre-ARNm. En segundo lugar, implementan el proceso de activación del pre-ARNm (splicing - corte de intrones, es decir, secciones inactivas de ARN que inhiben el proceso de síntesis de proteínas en el ARNm), después de lo cual comienza el ensamblaje de moléculas de proteína en la célula. En tercer lugar, las editasas promueven la formación de ARNm secundarios, que son represores de los mecanismos de expresión génica, lo que mantiene la densidad de la cromatina y el estado inactivo de los genes. Los productos proteicos sintetizados en estos ARNm secundarios, denominados proteínas silenciadoras o guardianes del genoma, están presentes en los óvulos humanos.

Así se presenta hoy el mecanismo de formación de líneas celulares inmortales de células madre embrionarias. En pocas palabras, la señal para iniciar el programa de embriogénesis, cuyas etapas iniciales consisten en la formación de la masa celular totipotente, proviene del citoplasma del óvulo. Si en esta etapa la masa celular interna del blastocisto (es decir, las células madre embrionarias) se aísla de otras señales reguladoras, el proceso de autorreproducción celular ocurre en un ciclo cerrado sin la participación de los genes del núcleo celular (epigenéticamente). Si dicha célula recibe nutrientes y se aísla de las señales externas que promueven la diferenciación de la masa celular, se dividirá y reproducirá su propia especie indefinidamente.

Los primeros resultados de los intentos experimentales de utilizar células totipotentes para trasplantes fueron bastante impresionantes: la introducción de células madre embrionarias en los tejidos de ratones con un sistema inmunitario debilitado por inmunosupresores condujo al desarrollo de tumores en el 100% de los casos. Entre las células de la neoplasia, cuya fuente eran células madre embrionarias (CME), se encontraron derivados diferenciados del material celular exógeno totipotente, en particular neuronas; sin embargo, el crecimiento de teratocarcinomas anuló el valor de los resultados obtenidos. Al mismo tiempo, en los trabajos de L. Stevens, las CME introducidas en la cavidad abdominal formaron grandes agregados en los que se formaron fragmentariamente músculos embrionarios, corazón, cabello, piel, huesos, músculos y tejido nervioso. (Los cirujanos que abren quistes dermoides deberían estar familiarizados con esta situación). Curiosamente, los embrioblastos de ratón suspendidos se comportan exactamente de la misma manera: su introducción en los tejidos de animales adultos inmunodeprimidos siempre provoca la formación de teratocarcinomas. Pero si se aísla una línea pura de células madre embrionarias de dicho tumor y se introduce en la cavidad abdominal, se forman nuevamente derivados somáticos especializados de las tres capas germinales sin signos de carcinogénesis.

Por lo tanto, el siguiente problema que debía resolverse era purificar el material celular de las impurezas de las células indiferenciadas. Sin embargo, incluso con una alta eficiencia de diferenciación celular dirigida, hasta el 20 % de las células del cultivo conservan su potencial totipotente, que in vivo, lamentablemente, se manifiesta en el crecimiento tumoral. Otra "honda" de la naturaleza: en la escala del riesgo médico, la garantía de recuperación del paciente se equilibra con la garantía de su muerte.

La relación entre las células tumorales y las células progenitoras pluripotentes embrionarias (EPPC), cuyo desarrollo es más avanzado que el de las células madre embrionarias (CME), es bastante ambigua. Los resultados de nuestros estudios han demostrado que la introducción de EPPC en diversos tumores trasplantables en ratas puede provocar la desintegración del tejido tumoral (G), un rápido aumento de la masa tumoral (D), su reducción (E-3) o no afectar el tamaño de la necrosis focal central espontánea del tejido neoplásico (I, K). Es evidente que el resultado de la interacción entre las EPPC y las células tumorales está determinado por el conjunto total de citocinas y factores de crecimiento que producen in vivo.

Cabe destacar que las células madre embrionarias, que reaccionan con carcinogénesis al contacto con tejidos adultos, se asimilan perfectamente a la masa celular del embrión, integrándose en todos sus órganos. Estas quimeras, compuestas por células propias del embrión y células madre embrionarias (CME) del donante, se denominan animales alofénicos, aunque, de hecho, no son quimeras fenotípicas. El sistema hematopoyético, la piel, el tejido nervioso, el hígado y el intestino delgado experimentan la máxima quimerización celular cuando se introducen CME en un embrión en etapa temprana. Se han descrito casos de quimerización de los genitales. La única zona inviolable para las CME son las células germinales primarias.

Es decir, el embrión conserva la información genética de sus padres, lo que protege la pureza y la continuidad tanto del género como de la especie.

En condiciones de bloqueo de la división celular del embrión temprano mediante citoclazina, la introducción de células madre embrionarias en el blastocisto conduce al desarrollo de un embrión cuyas células germinales primarias, como todas las demás, se formaron a partir de células madre embrionarias de donantes. Sin embargo, en este caso, el embrión en sí es completamente donante, genéticamente ajeno al cuerpo de la madre sustituta. Los mecanismos de este bloqueo natural de la posibilidad de mezclar la información hereditaria propia con la ajena aún no se han esclarecido. Cabe suponer que, en este caso, se lleva a cabo el programa de apoptosis, cuyos determinantes aún desconocemos.

Cabe señalar que la embriogénesis de animales de diferentes especies nunca está coordinada: al implementarse el programa de organogénesis del donante en el cuerpo del embrión receptor de células madre embrionarias xenogénicas, este muere intrauterinamente y es reabsorbido. Por lo tanto, la existencia de quimeras "rata-ratón", "cerdo-vaca" y "humano-rata" debe entenderse como un mosaicismo celular, no morfológico. En otras palabras, cuando se introducen células madre embrionarias (CME) de una especie de mamífero en el blastocisto de otra especie, siempre se desarrollan crías de la especie materna, en las que, entre las células propias de casi todos los órganos, se encuentran inclusiones y, en ocasiones, grupos de unidades estructurales y funcionales compuestas por material genéticamente ajeno a los derivados de las CME. El término "cerdo humanizado" no puede interpretarse como la designación de una especie de monstruo dotado de inteligencia o características externas humanas. Se trata simplemente de un animal cuyas células corporales provienen de CME humanas introducidas en el blastocisto de un cerdo.

Perspectivas para el uso de células madre

Se sabe desde hace tiempo que las enfermedades asociadas con la genopatología de las células hematopoyéticas y linfoide suelen eliminarse tras un trasplante alogénico de médula ósea. La sustitución del propio tejido hematopoyético por células genéticamente normales de un donante emparentado permite la recuperación parcial y, en ocasiones, completa del paciente. Entre las enfermedades genéticas que se tratan con trasplante alogénico de médula ósea, cabe destacar el síndrome de inmunodeficiencia combinada, la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, la granulomatosis crónica, el síndrome de Wiskott-Aldrich, las enfermedades de Gaucher y Hurler, la adrenoleucodistrofia, la leucodistrofia metacromática, la anemia de células falciformes, la talasemia, la anemia de Fanconi y el sida. El principal problema en el uso del trasplante alogénico de médula ósea para el tratamiento de estas enfermedades reside en la selección de un donante emparentado compatible con la HbA1c, para cuya búsqueda exitosa se requiere un promedio de 100 000 muestras de tejido hematopoyético tipificado.

La terapia génica permite corregir un defecto genético directamente en las células madre hematopoyéticas del paciente. En teoría, la terapia génica ofrece las mismas ventajas en el tratamiento de enfermedades genéticas del sistema hematopoyético que el trasplante alogénico de médula ósea, pero sin todas las posibles complicaciones inmunológicas. Sin embargo, esto requiere una técnica que permita la transferencia efectiva de un gen completo a las células madre hematopoyéticas y mantenga el nivel requerido de su expresión, que en ciertos tipos de patología hereditaria puede no ser muy alto. En este caso, incluso una pequeña reposición del producto proteico del gen deficiente produce un efecto clínico positivo. En particular, en la hemofilia B, un 10-20% del nivel normal de factor IX es suficiente para restaurar el mecanismo interno de la coagulación sanguínea. La modificación genética de material celular autólogo ha demostrado ser exitosa en el hemiparkinsonismo experimental (destrucción unilateral de neuronas dopaminérgicas). La transfección de fibroblastos embrionarios de rata con un vector retroviral que contiene el gen de la tirosina hidroxilasa aseguró la síntesis de dopamina en el sistema nervioso central: la administración intracerebral de fibroblastos transfectados redujo drásticamente la intensidad de las manifestaciones clínicas de un modelo experimental de enfermedad de Parkinson en animales de experimentación.

La perspectiva del uso de células madre para la terapia génica en enfermedades humanas ha planteado numerosos desafíos nuevos para médicos y experimentadores. Los aspectos problemáticos de la terapia génica se asocian con el desarrollo de un sistema seguro y eficaz para el transporte génico a la célula diana. Actualmente, la eficiencia de la transferencia génica a células grandes de mamíferos es muy baja (1%). Metódicamente, este problema se resuelve de diversas maneras. La transferencia génica in vitro implica la transfección de material genético en las células del paciente en cultivo, con su posterior retorno al organismo del paciente. Este enfoque debe considerarse óptimo cuando se utilizan genes introducidos en células madre de médula ósea, ya que los métodos para transferir células hematopoyéticas del organismo al cultivo y viceversa están bien establecidos. Los retrovirus se utilizan con mayor frecuencia para la transferencia génica a células hematopoyéticas in vitro. Sin embargo, la mayor parte de las células madre hematopoyéticas se encuentran en estado latente, lo que complica el transporte de información genética mediante retrovirus y requiere la búsqueda de nuevas formas de transporte génico eficaz a células madre latentes. Actualmente, se utilizan métodos de transferencia génica como la transfección, la microinyección directa de ADN en las células, la lipofección, la electroporación, la pistola génica, el acoplamiento mecánico con perlas de vidrio, la transfección de hepatocitos mediante acoplamiento de ADN dependiente del receptor a la asialoglicoproteína y la introducción del transgén por aerosol en las células del epitelio alveolar pulmonar. La eficiencia de la transferencia de ADN mediante estos métodos es del 10,0 al 0,01 %. En otras palabras, dependiendo del método de introducción de la información genética, se puede esperar éxito en 10 pacientes de cada 100 o en 1 paciente de cada 10 000. Es evidente que aún no se ha desarrollado un método eficaz y seguro para la transferencia de genes terapéuticos.

Una solución fundamentalmente diferente al problema del rechazo de material celular alogénico en el trasplante celular es el uso de altas dosis de células progenitoras pluripotentes embrionarias para lograr el efecto de reinstauración del sistema de control de la homeostasis antigénica de un organismo adulto (efecto Kukharchuk-Radchenko-Sirman). Esta solución, en esencia, reside en la inducción de tolerancia inmunológica mediante la creación de una nueva base de células inmunocompetentes con la reprogramación simultánea del sistema de control de la homeostasis antigénica. Tras la administración de altas dosis de EPPC, estas se fijan en los tejidos del timo y la médula ósea. En el timo, las EPPC, bajo la influencia de un microambiente específico, se diferencian en células dendríticas, interdigitadas y elementos epitelial-estromales. Durante la diferenciación de las EPPC en el timo del receptor, junto con las propias moléculas del receptor del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), se expresan moléculas del MHC que están determinadas genéticamente en las células del donante, es decir, se establece un doble estándar de moléculas del MHC, según el cual se realiza la selección positiva y negativa de los linfocitos T.

Así, la renovación del enlace efector del sistema inmune del receptor se produce a través de los mecanismos conocidos de selección positiva y negativa de los linfocitos T, pero a través del doble estándar de las moléculas del MHC: las EPPC del receptor y del donante.

La reprogramación del sistema inmunitario mediante EPPC no solo permite el trasplante celular sin el uso posterior de inmunosupresores a largo plazo, sino que también abre nuevas perspectivas en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y sienta las bases para el desarrollo de nuevas ideas sobre el proceso de envejecimiento humano. Para comprender los mecanismos del envejecimiento, hemos propuesto una teoría del agotamiento de los espacios madre del cuerpo. Según la premisa principal de esta teoría, el envejecimiento consiste en una reducción permanente del tamaño de los espacios madre del cuerpo, entendidos como un conjunto de células madre regionales ("adultas") (mesenquimales, neuronales, hematopoyéticas, células progenitoras de la piel, tracto digestivo, epitelio endocrino, células pigmentarias de los pliegues ciliares, etc.), que reponen las pérdidas celulares del tejido correspondiente en el proceso de remodelación corporal. La remodelación corporal consiste en la renovación de la composición celular de todos los tejidos y órganos gracias a las células madre, que continúa a lo largo de la vida de un organismo multicelular. El número de células en los espacios troncales está determinado genéticamente, lo que determina el tamaño limitado (potencial proliferativo) de cada espacio. A su vez, el tamaño de los espacios troncales determina la tasa de envejecimiento de cada órgano, tejido y sistema corporal. Tras el agotamiento de las reservas celulares de los espacios troncales, la intensidad y la tasa de envejecimiento de un organismo multicelular están determinadas por los mecanismos de envejecimiento de las células somáticas diferenciadas dentro del límite de Hayflick.

Por lo tanto, en la etapa de ontogénesis posnatal, la expansión de los espacios troncales no solo puede aumentar significativamente la esperanza de vida, sino también mejorar la calidad de vida al restaurar el potencial de remodelación del cuerpo. Esta expansión puede lograrse mediante la introducción de grandes dosis de células progenitoras pluripotentes embrionarias alogénicas, siempre que se reprograme simultáneamente el sistema inmunitario del receptor, lo que aumenta significativamente la esperanza de vida de los ratones viejos del experimento.

La teoría del agotamiento del espacio madre puede cambiar las ideas existentes no solo sobre los mecanismos del envejecimiento, sino también sobre la enfermedad, así como las consecuencias de su tratamiento farmacológico. En particular, la enfermedad puede desarrollarse como resultado de una patología de las células del espacio madre (oncopatología). El agotamiento de la reserva de células madre mesenquimales altera los procesos de remodelación del tejido conectivo, lo que conduce a la aparición de signos externos de envejecimiento (arrugas, flacidez cutánea, celulitis). El agotamiento de la reserva de células madre endoteliales provoca el desarrollo de hipertensión arterial y aterosclerosis. El tamaño inicialmente pequeño del espacio madre del timo determina su involución permanente precoz relacionada con la edad. El envejecimiento prematuro es consecuencia de la disminución patológica inicial del tamaño de todos los espacios madre del cuerpo. La estimulación farmacológica y no farmacológica de las reservas de células madre mejora la calidad de vida al reducir su duración, ya que reduce el tamaño de los espacios madre. La baja eficacia de los geroprotectores modernos se debe a su efecto protector sobre las células somáticas diferenciadas envejecidas, y no sobre los espacios madre del cuerpo.

En conclusión, queremos reiterar que la medicina regenerativa-plástica representa una nueva dirección en el tratamiento de enfermedades humanas, basada en el aprovechamiento del potencial regenerativo-plástico de las células madre. En este caso, la plasticidad se entiende como la capacidad de las células madre, exógenas o endógenas, de implantarse y generar nuevos brotes celulares especializados en las zonas de tejido dañado de un organismo enfermo. El objetivo de la medicina regenerativa-plástica son las enfermedades humanas mortales actualmente incurables, las patologías hereditarias, las enfermedades en las que los métodos de la medicina tradicional solo logran un efecto sintomático, así como los defectos anatómicos del cuerpo, cuya restauración es el objetivo de la cirugía regenerativa-plástica reconstructiva. En nuestra opinión, es prematuro considerar los primeros intentos de recrear órganos completos y funcionalmente completos a partir de células madre como un área independiente de la medicina práctica. El objeto de la medicina regenerativa-plástica son las células madre, que, según su origen, presentan un potencial regenerativo-plástico diferente. La metodología de la medicina regenerativa-plástica se basa en el trasplante de células madre o sus derivados.