Diagnóstico del herpes

El diagnóstico del herpes se basa en el aislamiento clásico del virus en cultivos de células sensibles, métodos de inmunofluorescencia y serológicos, examen colposcópico y el uso de métodos biológicos moleculares modernos (PCR, hibridación puntual), que permiten diagnosticar todo el grupo de virus del herpes, incluidos los tipos HHV-6 y HHV-7.

Métodos de diagnóstico de laboratorio para la infección por herpes

Los principales métodos destinados a aislar el VHS o detectar partículas virales y/o sus componentes	Métodos auxiliares destinados a detectar anticuerpos contra el VHS en fluidos biológicos del cuerpo humano.
Aislamiento de HSV en cultivos celulares y animales sensibles Microscopía electrónica directa e inmunitaria Variantes directas e indirectas del IPA IFA Métodos de biología molecular reacción de aglutinación de látex	Reacción de neutralización RSC Determinación de anticuerpos contra proteínas no estructurales del VHS-1,2

Se demostró que en el 76% de los pacientes, el herpes genital (GH) es causado por el VHS-2, y en el 24%, por el VHS-1. Además, el GH como monoinfección se presentó solo en el 22% de los pacientes, y en el 78% de los casos se detectaron asociaciones microbianas. En el 46% de los individuos, se detectó parasitocenosis causada por dos patógenos, incluyendo clamidia en el 40% de los casos. Gardnerella, Trichomonas y gonococos se detectaron con menor frecuencia en los frotis.

En el 27% de los pacientes, la parasitocenosis estuvo representada por tres patógenos, y en el 5,2%, por cuatro. Además, la combinación de clamidia con hongos del tipo gardnerella y cándida fue la más frecuente. Estos datos justifican la necesidad de un examen bacteriológico exhaustivo de los pacientes con GH para identificar combinaciones de agentes patógenos, así como un estudio profundo de la patogénesis de las infecciones mixtas del tracto urogenital, lo que permitirá una terapia compleja y diferenciada de la infección por herpes.

Materiales estudiados para el aislamiento de VHS dependiendo de la localización de las lesiones herpéticas

Localización de las lesiones	Contenido de la vesícula	Raspado de células				LCR	Aspirado bronquial	Biopsia	Sangre
		1	2	3	4
Cuero	+								+
Ojos			+						+
Genitales				+					+
Ano	+				+				+
Boca	+	+							+
Sistema nervioso central	+					+		+	+
Pulmones		+					+		+
Hígado								+	+
herpes congénito	+	+	+				+		+

Métodos de diagnóstico de laboratorio de la infección por citomegalovirus

Métodos	Tiempo necesario para obtener resultados	Notas
VIROLÓGICO
Microscopía electrónica	3 horas	No muy accesible
Aislamiento de virus en cultivo celular (VCI)	4-20 días	Estándar, Lento
Tinción de inmunofluorescencia de AG temprano utilizando anticuerpos monoclonales	6 horas	Menos específico
CITOLÓGICO	2-3 horas	Menos específico
SEROLÓGICO
RSC	2 días	Estándar
RGA	1 día	Trabajo intensivo
ARRECIFE	6 horas	Simple, específico
NRIF	6 horas	Difícil
RIMP	6 horas	Difícil
ELISA (IgM, DO)	6 horas	Rápido, sencillo
Inmunotransferencia	6 horas	Caro
BIOLÓGICA MOLECULAR
MG	5-7 días	Caro y laborioso
PCR	3 horas	Caro

Métodos de diagnóstico del virus del herpes zóster

Métodos de diagnóstico	Técnicas de laboratorio
INDIRECTO
Selección	Cultivo de tejidos, embriones de pollo, animales de laboratorio, cocultivo con células permisivas o virus auxiliares
Identificación de aislamientos	Reacción de neutralización, RSC, IF, PIEF, reacción de precipitación de aislados, aglutinación, IF
DIRECTO
Citología	Frotis: inmunofluorescencia en color
Histología	Patomorfología de la célula
Estructura	Microscopía embrionaria, microscopía inmunoelectrónica
Determinación de antígenos	IF, PIEF, RIM, IFA
Determinación de la producción local de anticuerpos	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Enfoques de biología molecular	Hibridación molecular, PCR

Diagnóstico de laboratorio de la infección causada por el virus del herpes zóster

Problemas de diagnóstico	Métodos	Resultados esperados
Infección primaria aguda	1	Detección en 2 horas
	2	Los niveles de anticuerpos están aumentando lentamente
	3	Presente 3 días después de la infección
Infección aguda reactivada	1	Detección de UUU después de 2 horas
	2	Los niveles de anticuerpos están aumentando lentamente
	4	Presente 4 días después de que aparece la erupción.

1. determinación de vesículas del VEGF en líquido;
2. serología: CSC, ELISA, dirigidas a la detección
3. serología: ELISA dirigida a detectar IgM;
4. serología: ELISA dirigida a detectar IgA, IgM.

Métodos para indicar la respuesta inmune a la infección por el virus del herpes zóster

Acercarse	Método
Detección de un aumento del título de anticuerpos en el segundo suero	RSK, RTGA, RPGA, reacción de neutralización IF, RIM, ELISA
Detección de anticuerpos específicos de las clases Ig G e Ig A en la primera muestra de suero	ELISA, IF, RIM, aglutinación de látex

Interpretación de los resultados del examen serológico de sueros de pacientes para infecciones por herpesvirus (ELISA)

Nombre de la infección/marcador	Valores umbral promedio para las infecciones
	Resultados del análisis	Interpretación
Citomegalia IgG anti-CMV (1-20 U/ml) IgM anti-CMV (100-300%)	Positivo 1-6 Positivo 6-10 Positivo >10 Negativo Positivo 100-300 Negativo <90 Dudoso 90-100	Remisión Exacerbación de la enfermedad Fase aguda de la enfermedad Ausencia de infección (enfermedad) Fase aguda de la enfermedad Repetir el análisis en 2-3 semanas
Herpes simple serotipos 1,2 Anti-HSV 1/2 total (100-900%)	Positivo 100-400 Positivo 400-800 Positivo >800 Negativo <100	Remisión Exacerbación de la enfermedad Fase aguda de la enfermedad Ausencia de infección (enfermedad)

En la tabla se presentan los principales métodos de diagnóstico de laboratorio de las infecciones por herpesvirus, así como los materiales biológicos recomendados que se examinan al aislar el VHS, teniendo en cuenta la localización de las lesiones herpéticas.

Aislamiento fiable de los virus del herpes simple y del CMV mediante la infección de cultivos celulares sensibles. Así, durante el examen virológico de 26 pacientes durante el período de recaída, se aisló el VHS en un cultivo de células Vero sensibles en 23 casos (88,4%). Los cultivos infectados mostraron un cuadro de acción citopática típico del VHS: la formación de células gigantes multinucleadas o una acumulación de células redondeadas y agrandadas en forma de racimos. En el 52,1 % de los casos, los focos de acción citopática del virus pudieron detectarse ya entre 16 y 24 horas después de la infección. Entre 48 y 72 horas de incubación de los cultivos infectados, el porcentaje de materiales que causaban destrucción celular específica aumentó al 87 %. Y solo en el 13 % de los casos se detectaron resultados positivos 96 horas después de la infección o más, o durante pases repetidos.

Métodos de diagnóstico de laboratorio de la infección generalizada por herpes

Los principales métodos destinados a detectar (aislar) los virus del herpes, sus partículas y sus componentes

Métodos auxiliares destinados a detectar anticuerpos contra virus del herpes en fluidos biológicos, detectar cambios enzimáticos en el suero sanguíneo

Aislamiento de virus del herpes en cultivos celulares y animales sensibles Microscopía electrónica directa e inmunológica Variantes directas e indirectas del método de inmunoperoxidasa Variantes directas e indirectas del método de anticuerpos fluorescentes Variantes del inmunoensayo enzimático en fase sólida Variantes del método de hibridación molecular (ADN-ADN) Reacción en cadena de la polimerasa Reacción de aglutinación de látex

Prueba de neutralización Prueba de fijación del complemento Prueba de aglutinación de látex Versión indirecta del método de anticuerpos fluorescentes Versión indirecta del método de inmunoperoxidasa Variantes del inmunoensayo enzimático en fase sólida Método de inmunotransferencia Método de fijación radial del complemento Determinación de los niveles de alanina y aspartato aminotransferasa

Se utilizan métodos serológicos para diagnosticar la mononucleosis infecciosa (infección causada por el virus de Epstein-Barr (VEB). La reacción de Paul-Bunnell con eritrocitos de carnero muestra un título diagnóstico de 1:28 o superior en una sola prueba de suero sanguíneo, o un aumento de 4 veces en los anticuerpos al examinar sueros pareados. Se utiliza la reacción de Hoff-Bauer con una suspensión al 4 % de eritrocitos de caballo formalinizados. El resultado se tiene en cuenta después de 2 minutos; en la mononucleosis infecciosa, la reacción es altamente específica.

Actualmente, se está desarrollando un método de inmunoensayo enzimático (EIA) para el diagnóstico de la mononucleosis infecciosa. En este caso, se determinan los anticuerpos IgG e IgM en el suero del paciente mediante la incubación con linfoblastos infectados con el VEB, seguida de un tratamiento con anticuerpos fluorescentes. En la fase aguda de la enfermedad, se determinan los anticuerpos contra el antígeno de la cápside viral con un título de 1:160 o superior.

Al utilizar diversos sistemas de prueba comerciales importados, la prueba ELISA puede detectar: anticuerpos contra la envoltura del VEB, anticuerpos contra el antígeno temprano del VEB, anticuerpos totales contra el antígeno temprano del VEB, determinados en la fase aguda de la enfermedad tanto en el núcleo como en el citoplasma celular, anticuerpos limitados contra el antígeno temprano del VEB, determinados en la fase aguda de la enfermedad tanto en el núcleo como en el citoplasma celular, anticuerpos limitados contra el antígeno temprano del VEB, determinados en el punto álgido de la enfermedad solo en el citoplasma celular, y anticuerpos contra el antígeno nuclear del VEB. El uso de estos sistemas de prueba permite el diagnóstico diferencial de diversas enfermedades asociadas con el VEB.

Tras un resultado positivo en la prueba ELISA que revela anticuerpos contra el VEB, se realiza una reacción de inmunotransferencia confirmatoria, que determina la presencia de anticuerpos contra las proteínas marcadoras individuales del VEB (proteínas p): p23, p54, p72 (la presencia de esta proteína indica la posibilidad de reproducción del VEB), p 138. Los métodos de laboratorio mencionados anteriormente también se utilizan para controlar la eficacia del tratamiento.

La sensibilidad de los métodos virológicos es del 85-100%, la especificidad del 100% y la duración del estudio es de 2 a 5 días. El método de inmunofluorescencia directa (IFD) con anticuerpos policlonales o monoclonales contra HSV-1 y HSV-2 se utiliza con frecuencia en la práctica clínica. El método IFD es fácilmente reproducible en un laboratorio clínico convencional, es económico, tiene una sensibilidad superior al 80% y una especificidad del 90-95%. La microscopía de inmunofluorescencia reveló la presencia de inclusiones citoplasmáticas, características morfológicas y el porcentaje de células infectadas en frotis de uretra, canal cervical, cérvix y recto.

El método PIF proporciona una idea de las propiedades morfológicas de las células y de los cambios en la localización de los antígenos del VHS. Además de los signos directos de daño celular causados por los virus del herpes (detección de luminiscencia específica), existen signos indirectos de infección por herpes según los datos del PIF:

• agregación de materia nuclear, desprendimiento del cariolema;
• la presencia de los llamados núcleos “agujero”, cuando sólo queda un cariolema del núcleo celular;
• la presencia de inclusiones intranucleares - cuerpos de Cowdry.

Al realizar la prueba de infusión in vitro (PIF), el médico recibe una evaluación tanto cualitativa como cuantitativa del estado de las células infectadas, lo cual se utilizó para evaluar la eficacia del tratamiento antiviral con aciclovir (AC). Así, se examinó a 80 pacientes con herpes genital simple (GH) mediante el método PIF en dinámica. Se demostró que, si bien antes del tratamiento con aciclovir, el 88 % de los pacientes presentaba un alto porcentaje de células infectadas (50-75 % o superior) en los frotis, tras un ciclo de aciclovir, se detectaron células sanas en los frotis del 44 % de los pacientes, en el 31 % de los casos se observaron células infectadas individuales y en el 25 % de los pacientes se observó hasta un 10 % de células infectadas.

Contenido de células infectadas en frotis (reacción PIF) de pacientes con herpes genital tratados con aciclovir

Periodos de enfermedad	Contenido porcentual en frotis
	Células infectadas					Células normales
	Más del 75%	50-75%	40-50%	10%	Células individuales en el campo de visión
Recaída (antes del tratamiento)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Remisión (después del tratamiento)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Utilizando el método PIF y la hibridación puntual durante muchos años, se ha observado que los resultados del estudio coinciden en casi el 100% de los casos. Cabe destacar que, para aumentar la fiabilidad del diagnóstico de herpes, especialmente en casos de formas subclínicas y poco manifiestas, se recomienda utilizar de 2 a 3 métodos de diagnóstico de laboratorio, especialmente al examinar a mujeres embarazadas, mujeres con antecedentes obstétricos desfavorables y personas con un diagnóstico ginecológico no especificado.

Por lo tanto, en el diagnóstico por PCR de infecciones virales y bacterianas del tracto urogenital, es necesario evaluar los resultados positivos obtenidos teniendo en cuenta la anamnesis y la presencia (o ausencia) de síntomas clínicos específicos de la enfermedad. Si se detecta clamidia mediante PCR, existe una alta probabilidad de infección y, en consecuencia, se pueden resolver los problemas de tratamiento. En caso de detección de micoplasmas (ureaplasmas), que son microorganismos oportunistas, se requieren estudios de cultivo adicionales para confirmar el diagnóstico, es decir, la siembra de material del paciente en cultivos celulares sensibles. Solo si se obtienen resultados positivos en el análisis de cultivo se puede hablar de confirmación de laboratorio del diagnóstico de micoplasmosis. El mismo método permitirá, si es necesario, determinar la sensibilidad de los micoplasmas aislados a las formas farmacéuticas de uso frecuente (antibióticos, fluoroquinolonas, etc.).

Es posible la infección simultánea con varios virus de la familia Herpesviridae. Con frecuencia, se detectó la infección de un mismo paciente con los virus HSV-1, HSV-2 y CMV. Los pacientes con manifestaciones clínicas y de laboratorio de IDS secundario (pacientes oncohematológicos, oncológicos y con infección por VIH) presentaron una frecuencia significativamente mayor de infección por varios virus herpes. Por lo tanto, se ha demostrado que los trastornos clínicos e inmunológicos que progresan en la infección por VIH se acompañan de un aumento en el número de virus herpes detectados mediante el método de hibridación molecular. En este caso, la detección simultánea compleja de ADN de tipo HSV-1, CMV y HHV-6 puede considerarse la más significativa desde el punto de vista pronóstico.

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