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Salud

Diagnóstico de laboratorio de tuberculosis

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Último revisado: 11.04.2020
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La tuberculosis es una enfermedad que es fácil de diagnosticar en las condiciones modernas y los logros científicos. El diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis es fundamental para otros métodos de diagnóstico, solo superado por los métodos de investigación con rayos X.

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Prueba de sangre clínica

En pacientes con tuberculosis, los cambios en el análisis general de la sangre no son patognomónicos. Con formas limitadas e inactivas de la tuberculosis hipocromía característica de eritrocitos en su cantidad normal. Cuando infiltrados masivos o neumonía caseosa, mientras que la prevalencia de la linfadenitis caseosa, lesiones intestinales específicos, así como para grandes pulmonar o sangrado postoperatorio y nota microcitosis eritropenia, oligohromaziyu, polihromaziyu. La macrocitosis, y especialmente poikilotsitoz se encuentran mucho menos a menudo, habitualmente con la anemia pesada. Número de reticulocitos en la etapa tuberculosis compensada rangos de 0,1 a 0,6%, con subcompensated - 0,6 a 1,0% y el 1% se caracteriza por los reticulocitos descompensados.

Cuando tuberculosis en algunos casos puede haber una leucocitosis moderada (hasta 15 mil de los leucocitos.), Menos radiación, que se producen en 2-7% de los pacientes con formas proceso que ocurre limitados y fácil y en 12,5% - por tuberculosis pulmonar destructiva y progresiva .

Los cambios más frecuentes ocurren en la fórmula leucocitaria. Marque tanto la neutrofilia relativa como la absoluta, un cambio moderado de la fórmula leucocitaria a la izquierda antes de los promielocitos. Los mielocitos son muy raros en el caso de la tuberculosis no complicada. Un aumento en el número de neutrófilos con granularidad patológica en el hemograma de un paciente con tuberculosis siempre indica la duración del proceso: en pacientes con tuberculosis severa, casi todos los neutrófilos contienen granularidad patológica. Cuando el brote tuberculoso cesa, el cambio nuclear se acerca comparativamente rápidamente a lo normal. La granularidad patológica de los neutrófilos generalmente persiste más tiempo que otros cambios en el hemograma.

El contenido de eosinófilos en la sangre periférica también varía según la fase del proceso y el estado alérgico del organismo. Su cantidad disminuye hasta aneosinofilia en brotes severos y prolongados de la enfermedad y, a la inversa, aumenta con la reabsorción de infiltrados y derrames pleurales, así como en las formas tempranas de tuberculosis primaria.

La mayoría de las formas de tuberculosis primaria se acompañan de linfopenia, que a veces se observa durante varios años, incluso después de la cicatrización de cambios específicos. La tuberculosis secundaria en la fase de exacerbación, dependiendo de la gravedad del proceso, puede ir acompañada de un número normal de linfocitos o linfopenia.

Ocupa un lugar especial la determinación de la velocidad de sedimentación de eritrocitos pruebas adicionales para evaluar proceso tuberculoso (ESR) que tiene un valor en la evaluación del proceso tuberculosis flujo y la identificación de sus formas activas. Aumento de la ESR indica la presencia del proceso patológico (infecciosa-inflamatoria, séptico supurativa, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Y es indicativa de su gravedad, pero los niveles normales no ESR siempre indican la ausencia de patología. La aceleración de la sedimentación de eritrocitos se ve facilitada por un aumento en el contenido de globulinas, fibrinógeno, colesterol en la sangre y una disminución en la viscosidad de la sangre. La desaceleración de la sedimentación de eritrocitos es característica de los estados acompañados de hemoconcentración, un aumento en el contenido de albúminas y ácidos biliares.

El hemograma en pacientes con tuberculosis cambia durante el tratamiento. Los cambios hematológicos desaparecen cuanto más rápido, más exitosa es la intervención terapéutica. Sin embargo, se debe tener en cuenta el efecto sobre la hemopoyesis de diversos fármacos antibacterianos. A menudo causan eosinofilia, en algunos casos leucocitosis, y más a menudo leucopenia hasta agranulocitosis y reacción linfoide-reticular. El control hematológico sistemático y el análisis correcto de los datos obtenidos son esenciales para evaluar el estado clínico del paciente, la dinámica del proceso y la efectividad del tratamiento utilizado.

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Análisis clínico de orina

Con la tuberculosis del sistema urinario, el análisis de orina es el principal método de diagnóstico de laboratorio. Puede observar leucocituria, eritrocituria, proteinuria, hipoisostenuria, tuberculosis micobacteriana, bacteriuria inespecífica.

La leucocituria es el síntoma más frecuente de tuberculosis en el sistema urinario antes de que se realice una quimioterapia específica y está ausente solo en casos excepcionales, por ejemplo, con la obliteración completa de la luz ureteral. Prueba Nechyporenko (determinación del número de leucocitos en 1 ml de orina) ayuda a evaluar de manera más objetiva el grado nefrotuberkuloze leucocituria con, y en algunos casos para identificar que en el análisis de orina normal. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la leucocituria puede ocurrir en pielonefritis aguda y crónica, cistitis, uretritis, cálculos renales y uréteres.

Eritrocituria. Así como leucocituria. Se consideran uno de los signos de laboratorio más frecuentes de tuberculosis del sistema genitourinario. La frecuencia de la hematuria depende de la prevalencia del proceso, aumenta a medida que se desarrolla el proceso destructivo de la tuberculosis en el riñón. La eritrocituria sin leucocituria es más típica en las primeras etapas de la tuberculosis renal. La hematuria, que predomina sobre la leucocituria, es un argumento importante a favor de la tuberculosis renal en su diferenciación con pielonefritis inespecífica.

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Análisis bioquímico de sangre

Con la tuberculosis, los cambios en algunos parámetros bioquímicos dependen principalmente de la fase del proceso, las complicaciones y diversas enfermedades concomitantes. En pacientes con tuberculosis inactiva de los pulmones y otros órganos, las fracciones de proteína y proteína totales del suero sanguíneo no se modifican y determinan su contenido normal.

En las formas agudas de la enfermedad, así como con la exacerbación y la progresión de formas crónicas de tuberculosis, el coeficiente de albúmina-globulina disminuye.

Esencial en la evaluación del estado funcional de daño orgánico y el hígado en tuberculosis y sus complicaciones es la determinación de suero total y bilirrubina directa, AST (ACT), la alanina aminotransferasa (ALT). Determinación dinámica del nivel de aminotransferasas. La bilirrubina en el tratamiento de pacientes con tuberculosis, especialmente en formas graves, es un componente obligatorio de un examen bioquímico de pacientes con tuberculosis y se realiza mensualmente.

La evaluación del estado funcional de los riñones incluye la determinación de la creatinina sérica y el cálculo de la tasa de filtración glomerular de acuerdo con la fórmula de Cockcroft-Gault. El cálculo de la tasa de filtración glomerular utilizando la muestra de Reberg da resultados menos precisos.

El objetivo principal de los estudios dinámicos bioquímicos de pacientes con tuberculosis es supervisar el curso del proceso, la detección oportuna de los efectos secundarios de los medicamentos y la corrección adecuada de los trastornos homeostáticos que surgen.

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Aplicación de métodos bioquímicos de investigación en tuberculosis extrapulmonar

El indicador más informativo es el contenido de ácido tuberculosteárico en fluidos biológicos, pero su definición se asocia con dificultades técnicas (la necesidad de cromatografía de gases y espectrometría de masas).

Medida prospectiva de la actividad de la adenosina desaminasa, una enzima, determinada en líquidos: sinovial, pericárdica, ascítica o espinal. Los principales productores de adenosina desaminasa son linfocitos y monocitos. La determinación de la actividad de la adenosina desaminasa en fluidos biológicos facilita el diagnóstico de sinovitis tuberculosa, tuberculosis de ganglios linfáticos, meningitis tuberculosa, serositis tuberculosa.

Algunos indicadores bioquímicos debido a su no especificidad se determinan solo en fluidos biológicos, cerca del foco de la lesión. Mida el nivel de indicadores en respuesta a la inyección subcutánea o intradérmica de tuberculina (generalmente antes y 48 y 72 horas después). Después de esto, el grado de incremento del nivel del marcador (en%) se calcula con respecto al nivel inicial.

La determinación óptima en la orina de la actividad de la enzima órgano-específica transamnidazy, la aparición de que se nota en la derrota de los riñones de la naturaleza distinta. El estudio de la transamidinasa se justifica solo en condiciones de inyección subcutánea de tuberculina con el fin de exacerbar el proceso inflamatorio local. Determine la actividad de transamidina en la orina inicialmente y 24-72 horas después de la introducción de 50 TE tuberculina. La ampliación de la fermentación en 2 veces y más permite en el 82% de los casos diferenciar la tuberculosis activa de los riñones de la exacerbación de la pielonefritis crónica.

Con la tuberculosis de los órganos genitales femeninos, se determinan las concentraciones de haptoglobina y dialdehído malónico en la sangre en las condiciones de una prueba de provocación de la tuberculina. La tuberculina inyectada por vía subcutánea en una dosis de 50 TE y 72 horas más tarde realizó un segundo estudio bioquímico. En el caso de la etiología de la tuberculosis, el grado de aumento en el nivel de haptoglobina no es inferior al 28%, y el nivel de malondialdehído es del 39% o más. También se usa la determinación de la actividad de la adenosina desaminasa en un fluido peritoneal obtenido del espacio de Douglas. El punteado se reexamina 72 horas después de la inyección intradérmica de tuberculina a dosis de 0,1 TE y 0,01 TE en la proyección de los órganos genitales internos en la pared abdominal anterior. A favor del proceso de tuberculosis, un aumento en la actividad de la adenosina desaminasa es del 10% o más en comparación con la inicial.

Cuando el ojo se ve afectado, se examina la reacción focal que ocurre en el ojo en respuesta a la estimulación antigénica. No es deseable desarrollar una respuesta pronunciada, acompañada de una disminución de las funciones visuales. Dado que la evaluación de las reacciones mínimas focales a menudo es difícil, para la objetivación de la conclusión se recomienda orientar en paralelo y en el grado de crecimiento en el suero sanguíneo de haptoglobina o adenosina desaminasa.

Todos los estudios bioquímicos deben llevarse a cabo junto con otros métodos.

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Investigación del sistema de coagulación sanguínea

Relevancia del estado de la investigación del sistema de coagulación de la sangre de TB es causada por la presencia de un número de pacientes con hemoptisis pulmonar tuberculosis o hemorragia pulmonar, así como las complicaciones hemocoagulation en el tratamiento quirúrgico de la tuberculosis. Además, el flujo latente de hemocoagulación intravascular que naturalmente acompaña a la tuberculosis afecta el curso de la enfermedad y la eficacia de la quimioterapia.

En pacientes con prevalencia de la tuberculosis pulmonar de componente inflamación exudativa de la disminución observada en la actividad de anticoagulación de la sangre. En los pacientes con una baja prevalencia de una lesión específica en los pulmones con un predominio de hemocoagulation productivo componente inflamatorio intravascular expresado ligeramente. En los pacientes con tuberculosis pulmonar con hemoptisis y el sistema de coagulación de la sangre estado hemorragia pulmonar es diferente: en los pacientes con pérdida de sangre bajo en el gemoptoe altura o inmediatamente después de su terminación hay un fuerte aumento de la capacidad de coagulación de la sangre debido a la intensificación grave de trombinoobrazovaniya manteniendo al mismo tiempo un aumento de la coagulación "estructural". En los pacientes con pérdida masiva de sangre observado la capacidad de coagulación descenso a costa de disminuir la concentración de fibrinógeno. Actividad del factor XIII, recuento de plaquetas. En la etapa de tratamiento quirúrgico en pacientes con formas limitadas de tuberculosis pulmonar con violaciónes significativas se produce homeostasis del sistema. Los pacientes con proceso generalizado en la ejecución de pnevmon- o plevropnevmonektomii frecuentemente desarrollan DIC, que puede tomar la forma de la "segunda enfermedad."

Para supervisar el estado de coagulación de la sangre en pacientes con tuberculosis pulmonar debe llevarse a cabo la determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), fibrinógeno, tiempo de trombina, índice de protrombina y tiempo de sangrado y el tiempo de coagulación.

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Investigación hormonal

Las observaciones experimentales y clínicas modernas indican la presencia de cambios en el estado hormonal en una inflamación pulmonar tuberculosa específica. Se demuestra que la corrección de la disfunción de los sistemas de la pituitaria-adrenal, pituitaria-tiroides y la función pancreática en conjunción con la terapia anti-TB contribuir a la activación de la fibrogénesis y la reparación en una inflamación específica de locus.

El estado funcional del sistema de hipófisis-tiroides es juzgado por el contenido en el suero sanguíneo de triyodotironina (T 3 ), tiroxina (T 4 ), la pituitaria hormona estimulante del tiroides (TSH). Se encontró que se detecta el hipotiroidismo subclínico en 38-45% de los pacientes con tuberculosis pulmonar, y más a menudo se diagnostica a los procesos formas diseminadas y fibro-cavernoso. En estas mismas formas más reducidas drásticamente los niveles tanto de T 3 y T 4, y llega un desequilibrio de estas hormonas en forma de aumento de la relación de T 4 / T s.

La función adrenocortical es evaluada por el nivel de cortisol en el suero sanguíneo, y la función endocrina del páncreas - la concentración de la insulina inmuno-reactiva. En la fase aguda de la enfermedad infecciosa, aumenta la necesidad de cortisol endógeno e insulina. La hiperinsulinemia también atestigua la resistencia a la insulina de los tejidos corporales, que es típica para cualquier proceso inflamatorio activo, en particular, específico. La determinación de la función glucocorticoide de las glándulas suprarrenales con tuberculosis pulmonar activa permite revelar la presencia de hipercorticismo en la mayoría de los pacientes. Los niveles normales de concentración en sangre de cortisol en el paciente con la inflamación infecciosa en el período agudo deben ser considerados como fracaso relativo de la función de glucocorticoides de la corteza suprarrenal que puede servir como base para contener dosis terapia de sustitución adecuada de los glucocorticoides.

Casi un tercio de los pacientes con tuberculosis pulmonar puede establecer que el nivel de insulinemia en ellos es bastante bajo y se acerca al límite inferior de la norma, mientras que 13-20% observa hiperinsulinismo significativo. Tanto el hipo e hiperinsulinismo relativo son factores de alto riesgo para el desarrollo de violaciones del metabolismo de carbohidratos en diversos grados. Estos cambios en la actividad funcional de las células B del páncreas requieren un control regular de la glucemia en pacientes con tuberculosis y la prevención oportuna de la diabetes mellitus. Además. Esto sirve como una justificación adicional para la conveniencia de usar dosis fisiológicas de insulina en la terapia compleja de la tuberculosis.

En general, los niveles más bajos de hormonas tiroideas y su hypercortisolemia desequilibrio e hiperinsulinismo mayor alcance en los pacientes con evolución grave del proceso tuberculoso, con extenso daño pulmonar y los síntomas graves de intoxicación por la tuberculosis.

Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

Los estudios microbiológicos son necesarios para identificar a los pacientes con tuberculosis, verificar el diagnóstico, controlar y corregir la quimioterapia, evaluar los resultados del tratamiento, en otras palabras, desde el momento en que el paciente se registra con tuberculosis antes de quitárselo.

Todos los programas y proyectos epidemiológicos se basan en una evaluación del número de excretores bacterianos, que no se puede hacer sin utilizar métodos de laboratorio para detectar micobacterias tuberculosis. En una encuesta de la llamada población no organizada, el porcentaje de invasores bacterianos alcanza 70 o más, lo que hace que los métodos de laboratorio sean un medio suficientemente efectivo para identificar a los pacientes con tuberculosis entre este grupo de población.

Los métodos microbiológicos tradicionales para diagnosticar la tuberculosis son estudios bacterioscópicos y culturales. Los métodos modernos consideran el cultivo de Mycobacterium tuberculosis en sistemas automatizados, el establecimiento de PCR. Sin embargo, todos estos métodos se combinan necesariamente con métodos bacteriológicos clásicos.

Colección de material de diagnóstico

La efectividad de los estudios de laboratorio depende en gran medida de la calidad del material de diagnóstico. El cumplimiento de las normas para la recolección, almacenamiento y transporte de material de diagnóstico y la implementación exacta del algoritmo de evaluación del paciente afecta directamente el resultado y garantiza la seguridad biológica.

Para las pruebas de tuberculosis, se utiliza una variedad de materiales. Debido al hecho de que la forma más común de lesiones tuberculosas TB logkih-, el material básico para la investigación debe tener en cuenta de esputo y otros tipos de traqueobronquial desmontable: superior secreciones del tracto respiratorio obtenidos después de la inhalación de aerosol: lavados bronquiales; enjuagues broncoalveolares; material obtenido por broncoscopia, y transtraqueal intrapulmonar biopsias de aspirados bronquiales, frotis laríngeos, exudados de heridas y frotis al.

La efectividad de la investigación aumenta si se lleva a cabo una recolección controlada de material de un paciente. Para este propósito, se asigna una habitación especialmente equipada o se adquieren taxis especiales. La recolección de material es un procedimiento peligroso, por lo tanto, es necesario recolectar material para investigación, observando las reglas de seguridad infecciosa.

El material para la prueba de Mycobacterium tuberculosis se recoge en frascos estériles con tapas bien apretadas para evitar la contaminación del ambiente y proteger el material recolectado contra la contaminación.

Los viales para la recolección de material de diagnóstico deben cumplir los siguientes requisitos:

  • debe estar hecho de material resistente a los impactos;
  • debería derretirse fácilmente durante la esterilización en autoclave;
  • tener suficiente volumen (40-50 ml):
  • tener una amplia abertura para la recolección de esputo (diámetro no inferior a 30 mm);
  • sea fácil de manejar, transparente o translúcido, para que pueda evaluar la cantidad y la calidad de la muestra recolectada sin abrir la tapa.

Para obtener resultados de investigación óptimos, se deben observar las siguientes condiciones:

  • Recolecte el material antes del comienzo de la quimioterapia;
  • el material para el estudio debe ser recolectado antes del consumo matutino de alimentos y medicinas;
  • para la investigación, es conveniente recolectar al menos 3 muestras de flema matutina. Reúna esputo por 3 días consecutivos;
  • el material recolectado debe ser entregado al laboratorio lo antes posible:
  • en el caso de que sea inmediatamente imposible entregar el material al laboratorio, se almacena en el refrigerador a una temperatura del aire de 4 ° C durante no más de 48 horas;
  • Al transportar el material, es necesario controlar de cerca la integridad de los viales.

El esputo correctamente recogido es mucoso o mucopurulento. El volumen óptimo del esputo probado es de 3-5 ml.

El esputo se recolecta bajo la supervisión de un profesional médico. Las personas responsables de la recolección de esputo deben seguir la implementación de ciertas reglas:

  • es necesario explicarle al paciente el propósito del estudio y la necesidad de expectorar no la saliva o el moco nasofaríngeo, sino el contenido del tracto respiratorio profundo. Esto se puede lograr como resultado de una tos productiva que ocurre después de varias (2-3) respiraciones profundas. También es necesario advertir al paciente que debe enjuagarse la boca con agua hervida para eliminar la parte principal de la microflora que crece en la cavidad oral y los residuos de comida que impiden el examen del esputo;
  • un trabajador médico que participe en la recolección de esputo, además de un albornoz y un sombrero, debe usar una máscara, guantes de goma y un delantal de goma;
  • de pie detrás del paciente, se le recomienda mantener el frasco lo más cerca posible de sus labios e inmediatamente separar en él la flema cuando tose, y debe estar provisto de que el flujo de aire se dirija lejos del trabajador de la salud:
  • Una vez completada la recolección de esputo, el trabajador de salud debe cerrar cuidadosamente el vial con una tapa y evaluar la cantidad y calidad del esputo recolectado. Luego, la botella se etiqueta y se coloca en un bix especial para su transporte al laboratorio.

Si el paciente no produce flema, la noche anterior y por la mañana temprano en el día de la recogida del material necesario darle un expectorante :. Un extracto de la raíz de malvavisco (mukaltin), bromhexina, ambroxol, etc - o aplicar una inhalación irrita el uso de los equipos instalados en la sala para recoger flema El material recolectado de esta manera no está sujeto a conservación y debe examinarse el día de la recolección. Para evitar su "sacrificio" en el laboratorio en la dirección debe hacer una marca especial.

Si no se llevan a cabo estudios microbiológicos en esta instalación, el material de diagnóstico recogido debe entregarse en el laboratorio, siempre que el material se conserve en los intervalos entre las entregas en el refrigerador o con el uso de conservantes. Entregue material al laboratorio en cajas de transporte, que puedan desinfectarse fácilmente. Cada muestra debe proporcionarse con la etiqueta apropiada, y el lote completo debe llenarse con un formulario adjunto.

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Modos y frecuencia de examen de pacientes

En el examen inicial, llamado diagnóstico, del paciente para la tuberculosis, es necesario examinar al menos 3 porciones de esputo durante 2 o 3 días. Recogidos bajo la supervisión del personal médico, lo que aumenta la eficacia de la microscopía.

La detección primaria de la tuberculosis debe llevarse a cabo por todas las instituciones de diagnóstico médico del sistema de atención de la salud. Recientemente, los llamados centros de microscopía, equipados con modernos microscopios y equipos para la seguridad epidémica, se han organizado sobre la base de laboratorios de diagnóstico clínico para mejorar la eficiencia del examen inicial.

En las instalaciones contra la tuberculosis, se utiliza una prueba de detección que incluye el examen de esputo u otro material de diagnóstico por al menos 3 veces durante 3 días. Durante el tratamiento, los estudios microbiológicos se realizan regularmente al menos una vez al mes durante la fase de quimioterapia intensiva. En la transición a la fase de tratamiento, los estudios se realizan con menos frecuencia, con un intervalo de 2-3 meses, mientras que la frecuencia del estudio se reduce a dos.

Características de la colección de material de diagnóstico para tuberculosis extrapulmonar

Característica de material patológico con formas extrapulmonares de TB - Mycobacterium tuberculosis baja concentración en el mismo, lo que requiere un métodos más sensibles de los estudios microbiológicos, principalmente en medio técnicas de siembra.

Con la tuberculosis del sistema genitourinario, la orina es el material de estudio más accesible. La recolección de orina debe ser realizada por una enfermera especialmente capacitada.

Los genitales externos se lavan con agua con jabón o una solución débil de permanganato de potasio. La abertura externa de la uretra se trata con cuidado. En un vial estéril, se recoge una porción promedio de la orina de la mañana: en hombres, naturalmente, en mujeres, usando un catéter. La orina de la pelvis renal se recoge en tubos estériles con cateterismo de uno o dos riñones, en este último caso, necesariamente por separado de cada riñón. Una pequeña cantidad de esta orina se centrifuga, el sedimento se examina.

En los hombres, los espermatozoides, los testículos punteados, el secreto de la próstata se somete a centrifugación para obtener un precipitado. Con cualquier localización de un proceso específico en el área genital en los hombres, el masaje de próstata puede promover la secreción de secreciones que contienen mycobacterium tuberculosis.

La sangre menstrual en las mujeres se recolecta succionando o usando una gorra de Kafka. El material obtenido se libera de los glóbulos rojos, se lava con agua destilada y luego se centrifuga. El precipitado es examinado.

Las asignaciones del canal cervical del útero se recogen con alguna capacidad o cápsula de Kafka, es decir, es deseable acumular 1-2 ml de material patológico.

Material obtenido de intervenciones quirúrgicas en riñones, genitales. Con biopsias, raspaduras del endometrio, homogeneizar. Para hacer esto, se coloca en un mortero estéril y se tritura completamente con tijeras estériles. A esta suspensión se añadió arena de río estéril en una cantidad igual a su peso, y luego se reponía con 0,5-1.0 ml de solución isotónica de cloruro sódico, y todo se trituró hasta una masa pastosa con la adición de solución de cloruro sódico isotónica (4-5 ml). Luego la masa se deja reposar durante 1-1.5 minutos, se examina el sobrenadante.

Tuberculosis de huesos y articulaciones. El punteado (pus de abscesos) obtenido con una jeringa estéril se coloca en platos estériles y se envía inmediatamente al laboratorio. Pipeta estéril, previamente humedecida con solución de cloruro de sodio isotónica estéril, tome 2-5 ml de pus, transfiéralo a un frasco de perlas y agregue otros 2-3 ml de solución isotónica de cloruro de sodio. La botella se cierra con un corcho y se agita en un aparato bromista durante 8-10 minutos. La suspensión homogeneizada se examina.

En las formas fistulosas de tuberculosis osteoarticular, se toma pus de la fístula. La descarga copiosa se recoge directamente en un tubo de ensayo. En casos de escasa excreción de pus, la fístula se lava con una solución de cloruro de sodio isotónica estéril y el agua de lavado recogida en un tubo de ensayo o en un tampón impregnado con pus se envía al estudio.

El material quirúrgico obtenido durante intervenciones quirúrgicas en huesos y articulaciones puede consistir en masas purulentas-necróticas, granulaciones, tejido cicatricial, tejido óseo, tejido de membrana sinovial y otros sustratos. Su tratamiento se realiza, como en la tuberculosis de los riñones.

El estudio microbiológico del líquido sinovial en una solución de citrato sódico al 3% (relación 1: 1) para prevenir la coagulación se realiza inmediatamente después de la punción.

Tuberculosis de los ganglios linfáticos. El pus, extraído durante la punción de los ganglios linfáticos, también se examina. Como pus de los abscesos. Se examinan los tejidos de los ganglios linfáticos obtenidos durante intervenciones quirúrgicas, biopsias, como con otras formas de tuberculosis.

El estudio de las masas de heces en Mycobacterium tuberculosis es extremadamente raro, debido a la falta casi total de resultados positivos.

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Microscopio de Mycobacterium

La microscopía de esputo es un método relativamente rápido, simple y económico que debe utilizarse en todos los casos con sospecha de tuberculosis. Además, este estudio se realiza para evaluar la efectividad de la quimioterapia y para determinar la recuperación o falla del tratamiento si no hay una prueba de cultivo.

Se usan dos métodos de examen microscópico:

  • método de microscopía directa, cuando se prepara un frotis directamente del material de diagnóstico;
  • método de microscopía de un sedimento preparado a partir de material tratado descontaminante para cultivo.

El primer método se usa en aquellos laboratorios donde solo se llevan a cabo estudios microscópicos (laboratorios clínicos y de diagnóstico de la red médica general).

Los mejores resultados del examen microscópico se obtienen concentrando el material de diagnóstico (por ejemplo, mediante centrifugación).

Para detectar mycobacterium tuberculosis con una probabilidad del 50% al realizar la microscopía, 1 ml de esputo debe contener más de 5000 células microbianas. El esputo de pacientes con formas pulmonares de tuberculosis generalmente contiene una cantidad significativa de bacterias ácido-resistentes, lo que permite detectarlas de manera confiable mediante bacterioscopía. La sensibilidad diagnóstica de este método puede aumentar si se examinan varias muestras de esputo de un paciente. Un resultado negativo de un examen bacterioscópico no excluye el diagnóstico de tuberculosis, ya que el esputo de algunos pacientes contiene menos micobacterias de las que se pueden detectar con el microscopio. La mala preparación del frotis de esputo también puede causar un resultado negativo de un examen bacterioscópico.

El método más común para la detección de micobacterias ácido-alcohol resistentes en el frotis es el color según Tsiol-Nelsen. El método se basa en la penetración de la fucsina carbólica en una célula microbiana a través de una membrana que incluye una capa de lípidos céreos, mientras que simultáneamente se calienta y se produce una fuerte acción de ataque del fenol. La decoloración posterior del frotis con una solución al 25% de ácido sulfúrico o ácido clorhídrico al 3% conduce a una decoloración de todas las estructuras no ácidas-rápidas. Los elementos decolorados del frotis se tiñen con una solución al 0,3% de azul de metileno. Las micobacterias no perciben los tintes de anilina habituales, como resultado de lo cual las micobacterias ácido-resistentes se tiñen de rojo carmesí y otros microbios y elementos celulares, en azul.

Para frotis teñidos por Ziehl-Nelsenu utilizar microscopio binocular de luz con lentes de inmersión en aceite (aumento de 90 o 100 veces) y el ocular para la ampliación 7- o 10 veces. Explore 100 campos de visión, que es suficiente para identificar micobacterias únicas en el frotis. En caso de que el resultado de dicho estudio sea negativo, para su confirmación, se recomienda ver otros 200 campos de visión. Registre los resultados, indicando la cantidad de bacilos ácido-resistentes detectados (KUM).

Además de esta técnica, los fluorocromos de color se utilizan para la microscopía luminiscente, lo que permite lograr los mejores resultados. El uso de este método aumenta la eficacia de la microscopía en un 10-15%. Cuando se tratan micobacterias con tintes luminiscentes (auramina, rodamina, etc.), estas sustancias también se unen a las estructuras similares a la cera de la célula microbiana. Al irradiar células coloreadas con una fuente de luz excitante (un cierto espectro de radiación ultravioleta), comienzan a brillar con luz naranja o rojo brillante sobre un fondo negro o verde oscuro. Debido al alto brillo y contraste de la imagen visible, la ampliación global del microscopio se puede reducir 4-10 veces, el campo de visión se amplía y el tiempo de visualización de la preparación disminuye. Junto con esto, debido a la profundidad de campo mucho mayor, puede aumentar la comodidad del estudio.

Cuando se usa la microscopía de fluorescencia para ver la misma área, el frotis gasta significativamente menos tiempo que con la microscopía óptica de la tinción de Tsiol-Nelsen. Si durante un día de trabajo un microscopio examina aproximadamente 20-25 de dichos frotis, luego con la ayuda de microscopía de fluorescencia, puede examinar más de 60-80 muestras al mismo tiempo. Los microscopistas experimentados saben que la coloración de las células con una mezcla de auramina y rodamina es de alguna manera específica para los bacilos acidorresistentes, que en este caso se parecen a los palitos de oro. Los saprófitos están pintados en un color verdoso.

Otra ventaja importante del método de microscopía fluorescente - la capacidad de detectar Mycobacterium alterado, perdió bajo la influencia de factores adversos, incluyendo la quimioterapia intensiva, la propiedad kislotousotoychivosti y no se detecta en relación con esta tinción de Ziehl-Nelsenu.

Las desventajas del método de microscopía de fluorescencia incluyen el costo relativamente alto del microscopio y su funcionamiento. Sin embargo, en laboratorios centralizados u otros laboratorios grandes, donde la carga excede la norma de 3 técnicos de laboratorio que trabajan con tres microscopios convencionales, es más barato usar un microscopio fluorescente en su lugar.

Los métodos bacterioscópicos tienen una especificidad bastante alta (89-100%). Alrededor del 97% de los resultados positivos obtenidos por cualquier método de microscopía se confirman sin ambigüedad por los resultados de la siembra.

Cabe señalar que cuando el examen microscópico del frotis de material patológico, es imposible determinar la especie perteneciente a las micobacterias ácido-resistentes identificadas. Método de microscopía permite dar una opinión sólo en la presencia o ausencia de ácido en la preparación de microorganismos, que puede explicarse por la existencia en la naturaleza de un gran número de morfológicamente similares a los microorganismos complejos micobacterias tuberculosas de ácidos no tuberculosas resistentes.

Los resultados de la microscopía se evalúan en unidades semicuantitativas.

Con el fin de poder comparar los resultados de diferentes métodos de microscopía, se administran coeficientes empíricos. Por ejemplo, para comparar los resultados de frotis teñidos con tintes fluorescentes, la luz del microscopio de investigación de datos (1000 veces de aumento), es necesario dividir el número de bacilos acidorresistentes detectada por el microscopio de fluorescencia, el coeficiente correspondiente a 250 veces de aumento - a 10, 450 veces, a 4, con 630 veces, a 2.

Características de la microscopía para la tuberculosis extrapulmonar

Se realiza microscopía directa, así como microscopía de frotis preparados después del enriquecimiento, seguido de tinción de Tsiol-Nelsen o tintes luminiscentes. La microscopía directa de frotis es ineficaz debido a la baja concentración de micobacterias en el material y, por lo tanto, es más racional utilizar métodos de enriquecimiento. El más efectivo es la centrifugación. Si el material biológico es viscoso, se utiliza la centrifugación con homogeneización y licuefacción simultáneas del material, que se lleva a cabo utilizando centrífugas de alta velocidad con una fuerza de centrifugación de 3000 gy soluciones de hipoclorito. Otros métodos de enriquecimiento, como la micro flotación, no se utilizan actualmente debido a la formación de aerosoles biológicamente peligrosos.

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El método cultural de diagnóstico de la tuberculosis

El método de siembra, o el método de cultivo, es más sensible que la microscopía de frotis, y tiene una serie de ventajas sobre este último. Permite detectar varias docenas de micobacterias viables en el material de prueba y tiene un gran valor diagnóstico. Esto es especialmente importante cuando se examina el material de pacientes recién diagnosticados o tratados que liberan una pequeña cantidad de micobacterias.

En comparación con la microscopía, la investigación en cultivo permite aumentar el número de pacientes con TB diagnosticados en más del 15-25%, así como verificar la tuberculosis en etapas más tempranas, cuando la enfermedad todavía es susceptible de tratamiento. Una ventaja muy importante de la prueba de cultivo es la posibilidad de obtener un cultivo excitador que pueda identificarse y estudiarse con respecto a la sensibilidad a los medicamentos, la virulencia y otras propiedades biológicas.

Las desventajas de los métodos de cultivo incluyen su duración (el tiempo de espera de los materiales alcanza las 10 semanas). Mayor costo, complejidad del procesamiento del material de diagnóstico.

Principios del tratamiento previo del material de diagnóstico

Los métodos microbiológicos convencionales no pueden usarse en la realización de estudios sobre tuberculosis. Esto es debido al hecho. Que mycobacterium tuberculosis crece muy lentamente, y la mayoría de las muestras clínicas contienen microorganismos piógenos y putrefactos de crecimiento rápido, hongos. Su rápido crecimiento en medios ricos en nutrientes interfiere con el desarrollo de micobacterias y no permite aislar el agente causante de la tuberculosis, por lo que el material de diagnóstico debe ser pretratado antes de la siembra. Además, las micobacterias liberadas de las vías respiratorias del paciente generalmente están rodeadas por una gran cantidad de moco, por lo que es difícil concentrarse. En este sentido, antes de plantar esputo y otros materiales similares, su licuefacción, la descontaminación es necesaria.

Todos los detergentes y descontaminantes tienen un efecto tóxico más o menos pronunciado sobre las micobacterias. Como resultado del procesamiento, hasta el 90% de las micobacterias pueden morir. Para mantener suficiente de la población micobacteriana, evitando la necesidad de utilizar técnicas de procesamiento que permiten, por una parte, suprimir el rápido crecimiento de bacterias piógenas y pútrido, y por el otro - para preservar la viabilidad de las micobacterias presentes en el material.

Dependiendo del material, su grado de homogeneidad y de la contaminación para el pre-procesamiento utilizando diversos descontaminante: esputo - solución al 4% de hidróxido de sodio, las soluciones trohzameschonnogo fosfato de sodio 10%, cloruro de benzalconio, fosfato trisódico, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteína hidróxido de sodio) a una concentración final de 1% de NaOH, en la orina y otros materiales líquidos - solución de ácido sulfúrico al 3%, para las muestras contaminadas, materiales que contienen grasa - solución de ácido oxálico al 5%. Además, en algunos casos, se usan enzimas, surfactantes (detergentes). Aplicación detergentes Tween y alguna otra muerte micobacteriana se acompaña de menos células (40-50% sobreviven). Sin embargo, solo pueden usarse para materiales líquidos. La distribución más grande en el mundo fue NALC-NaOH. Producido en conjuntos. Este método permite asignar más del 85% de la población de células micobacterianas. Descontaminación tkanesoderzhaschih sólidos más difícil de adivinar porque el grado de dispersión del material durante la homogeneización difícil. Por ejemplo, las biopsias de tratamiento de los ganglios linfáticos a menudo acompañados de aumento de la frecuencia de la contaminación con flora extraños. En este caso, se puede usar 1% de etonio.

El material no homogéneo se homogeneiza con perlas de vidrio en presencia de descontaminantes. Los materiales líquidos se centrifugan previamente y solo se trata un precipitado.

Técnicas de siembra e incubación

Después del pretratamiento, el material se centrifuga, lo que precipita las micobacterias y aumenta su contenido en el sedimento ("enriquecimiento del lodo"). El precipitado resultante se neutraliza y se inocula (inocula) con medios nutritivos densos o tubos con medios líquidos (semilíquidos). Del resto del sedimento, los frotis se preparan para el examen microscópico. La técnica de siembra debe evitar la contaminación cruzada del material de diagnóstico.

Para una interpretación clínica confiable de los resultados de un estudio microbiológico, se debe observar la siguiente regla: se deben realizar estudios microscópicos y de cultivo en paralelo a partir de la misma muestra del material de diagnóstico.

Los tubos inoculados se colocan en un termostato a 37 ° C durante 2 días en posición horizontal. Esto asegura una absorción más uniforme del material en el medio de cultivo. Después de 2 días, los tubos se transfieren a una posición vertical y se sellan herméticamente con tapones de caucho o silicona para evitar el secado de los medios sembrados.

Los cultivos se incubaron a 37 sobre C durante 10-12 semanas con la visualización semanal regular. Para cada vista previa, se registran los siguientes parámetros:

  • el período observado visualmente desde el día del crecimiento de la siembra;
  • tasa de crecimiento (número de CFU);
  • contaminación del cultivo por una flora u hongos microbianos extraños (tales tubos se eliminan);
  • falta de crecimiento visible. Los tubos se dejan en el termostato hasta la próxima visualización.

Medios nutrientes

Diversos medios nutrientes se usan para el cultivo de micobacterias; denso, semi-líquido, líquido Sin embargo, ninguno de los medios nutrientes conocidos tiene propiedades que aseguren el crecimiento de todas las células micobacterianas. En relación con esto, se recomiendan 2-3 medios nutrientes de diferente composición para usarse simultáneamente para aumentar la efectividad.

La OMS recomienda el medio ambiente Levenstein-Jensen como el medio estándar para el aislamiento primario del agente causante de la tuberculosis y para determinar su sensibilidad a los medicamentos. Este es un ambiente de huevo denso en el que se obtiene el crecimiento de micobacterias en el día 20-25 después de la siembra de un material bacterioscópicamente positivo. Los cultivos de material bacterioscópicamente negativo requieren un período de incubación más largo (hasta 10-12 semanas).

En nuestro país, la propuesta E.R. Ambiente del huevo Finn Finn-II. Difiere en que, en lugar de L-asparagina, usa glutamato de sodio, que desencadena otras formas de sintetizar los aminoácidos de las micobacterias. El crecimiento aparece en este medio algo antes, y la frecuencia de asignación de micobacterias es 6-8% más alta que en el medio Lowenstein-Jensen.

Para mejorar la efectividad del diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis extrapulmonar, es aconsejable incluir medios de Finn-II modificados en el complejo de medios nutritivos. Para acelerar el crecimiento, se agrega adicionalmente al medio nutriente Finn-II un tioglicolato sódico al 0.05%, que reduce la concentración de oxígeno. Para proteger los sistemas enzimáticos de las micobacterias de los productos tóxicos de la peroxidación de lípidos en el medio nutriente Finn-II, se agrega acetato de antioxidante α-tocoferol a una concentración de 0.001 μg / ml. La siembra del material de diagnóstico se lleva a cabo de acuerdo con un procedimiento estándar.

En los laboratorios antituberculosos de Rusia, también se utilizan otras modificaciones de medios nutritivos densos; propuesto G.G. Medio nutritivo de Mordoviano "Nuevo", desarrollado por V.A. Medios nutritivos anicic A-6 y A-9, etc.

Debido al hecho de que en el proceso de la quimioterapia es el daño a varios sistemas metabólicos de las células microbianas, alguna población micobacteriana pierde la capacidad de desarrollarse normalmente en medios nutrientes convencionales y requiere osmóticamente equilibrada medios de cultivo (o semi-líquido).

Evaluación y registro de resultados de siembra de material de diagnóstico

Algunas cepas y especies de micobacterias crecen lentamente, el crecimiento puede aparecer incluso al día 90. El número de tales cultivos es pequeño, pero esto permite resistir cultivos en un termostato durante 2.5-3 meses.

Los cultivos virulentos de Mycobacterium tuberculosis generalmente crecen en ambientes de huevos densos en forma de colonias en forma de R de diversos tamaños y especies. Colonias secas, arrugadas, marfil, ligeramente pigmentadas. En otros medios, la colonia de Mycobacterium tuberculosis puede ser más húmeda. Después de un ciclo de quimioterapia o durante el tratamiento, se pueden asignar colonias lisas con crecimiento húmedo (formas S).

Al aislar cultivos, se utiliza un conjunto de estudios especiales para distinguir a Mycobacterium tuberculosis de micobacterias no tuberculosas y saprófitos resistentes a los ácidos.

Se da una respuesta positiva después de un examen microscópico obligatorio del frotis Tsiol-Nelsen teñido de las colonias crecidas. En el caso del crecimiento de micobacterias en frotis, se encuentran barras de color rojo brillante que se encuentran individualmente o en grupos formando grupos en forma de fieltro o trenzas. En cultivos jóvenes, especialmente aisladas de tratamiento a largo plazo de los pacientes con quimioterapia, micobacterias difieren el polimorfismo expresado, hasta que la presencia de la varilla en forma de, junto con versiones cortas, casi cocoides o alargados que se asemejan a micelio.

La tasa de crecimiento de micobacterias se indica mediante el siguiente esquema: (+) - 1-20 ufc in vitro (escasa excreción bacteriana); (++) - 20-100 UFC in vitro (excreción bacteriana moderada); (+++) -> 100 UFC in vitro (abundante excreción bacteriana). En el diagnóstico de laboratorio de tuberculosis, no es suficiente responder si la micobacteria se detecta por uno u otro método. Tener una comprensión detallada de la extensión y naturaleza de la población de micobacterias, su composición y propiedades. Son estos datos los que nos permiten interpretar correctamente el estado del proceso, planificar tácticas y corregir oportunamente el tratamiento.

En los últimos años, para acelerar el crecimiento de micobacterias, se han propuesto medios nutritivos a base de agar con diversos aditivos de crecimiento y el uso de una mezcla especial de gases. Para obtener el crecimiento de micobacterias en estos medios, durante el cultivo, se crea una atmósfera con un alto contenido de dióxido de carbono (4-7%). Las incubadoras especiales de CO 2 se usan para este propósito . Sin embargo, los sistemas automatizados más desarrollados para el cultivo de micobacterias: MGIT-BACTEC-960 y MB / Bact.

Uno de tales sistemas - sistema MGIT (tubo que indica un crecimiento de micobacterias), que se refiere al desarrollo de alta tecnología y está destinada para el diagnóstico bacteriológico rápido de la tuberculosis y la susceptibilidad Mycobacterium a fármacos de primera línea, y algunos medicamentos de segunda línea. MGIT se centra en usarlo como parte del dispositivo VASTES-960. Los microorganismos se cultivan en tubos especiales con un medio nutriente líquido basado en el medio modificado Middlebrook-7H9. Para estimular el crecimiento de micobacterias y suprimir el crecimiento de la microflora extraña, se usa el suplemento de crecimiento MGIT y una mezcla de fármacos antibacterianos PANTA.

El crecimiento de microorganismos se registra ópticamente. Se basa en la fluorescencia, que ocurre cuando las micobacterias consumen oxígeno durante el crecimiento. El tinte fluorocromático dependiente de oxígeno se encuentra en el fondo de un tubo de ensayo especial y se cubre con una capa de silicona. Micobacterias Reproducción conduce a una disminución de la cantidad de oxígeno en el tubo y la reducción de la concentración que provoca un aumento en la fluorescencia, que se hace visible bajo irradiación por tubos de luz ultravioleta y fotosensor registrado automáticamente incorporado en VASTES-960 de electrodomésticos. La intensidad de la luminiscencia se registra en unidades de crecimiento (unidades de crecimiento GU). Los datos de crecimiento se registran en la computadora, donde se pueden guardar automáticamente. El análisis por ordenador de curvas de crecimiento puede proporcionar información sobre la presencia de una variedad de piscinas de micobacterias, incluyendo no tuberculosas, y también ayuda a evaluar las propiedades de crecimiento de las micobacterias.

Como resultado del tiempo de aparición de tales sistemas de crecimiento de micobacterias se reduce significativamente, con un promedio de 11 días VASTES-960 y 19 días en MB / Bact a 33 días en el medio estándar de nutrientes sólido. Cabe señalar que estos sistemas requieren personal altamente calificado. La siembra del material en medios líquidos se acompaña necesariamente de la siembra en el medio Levenstein-Jensen, que desempeña el papel de respaldo en aquellos casos en que la micobacteria tuberculosis no da lugar a otros medios.

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Determinación de la sensibilidad a medicamentos de micobacterias

La determinación del espectro y el grado de sensibilidad de las micobacterias a los medicamentos antituberculosos es de gran importancia clínica, así como para la evaluación epidemiológica de la propagación de la tuberculosis con resistencia a los medicamentos. Además, el monitoreo de la resistencia a los medicamentos permite evaluar la efectividad del programa de tuberculosis en su conjunto, y es un indicador integral del desempeño de todos los componentes de las actividades contra la tuberculosis.

Multiplicidad y tiempo de sensibilidad a los medicamentos:

  • antes del inicio del tratamiento una vez para determinar la estrategia y las tácticas de tratamiento:
  • cuando se aislan de cultivos enfermos de diversos materiales (esputo, líquido BAL, orina, exudados, licor, etc.), se examinan todas las cepas aisladas:
  • al final de la fase intensiva de tratamiento en ausencia de dinámica clínica y radiológica:
  • si es necesario cambiar el régimen de tratamiento en los siguientes casos:
    • ausencia de frotis de esputo;
    • re-aislamiento del cultivo después del frotis de esputo negativo;
    • un aumento drástico en el número de CMU en el hisopo después de la disminución inicial. Es bien sabido que las cepas de Mycobacterium tuberculosis, que son heterogéneas en términos de sensibilidad a los fármacos, se aíslan del material de un paciente con tuberculosis. La sensibilidad de las cepas a los medicamentos antituberculosos puede diferir en el rango de fármacos, grado, frecuencia y tasa de aparición de resistencia.

El grado de resistencia a los medicamentos de Mycobacterium tuberculosis se determina de acuerdo con los criterios establecidos que están orientados hacia la importancia clínica de la resistencia y dependen de la actividad antituberculosa del fármaco, su farmacocinética, concentración en el foco de la lesión. La dosis terapéutica máxima, etc.

La determinación de la sensibilidad a los medicamentos de las micobacterias se lleva a cabo actualmente por métodos microbiológicos:

  • Concentraciones absolutas (método de dilución en medios nutritivos densos o líquidos),
  • proporciones,
  • coeficiente de resistencia.

Usualmente, la resistencia se manifiesta en la forma de un crecimiento visualmente observado de las colonias de Mycobacterium tuberculosis, pero existen métodos que inducen el crecimiento en las primeras etapas de la división celular de las micobacterias en forma de reacciones de color. Estos métodos acortan el tiempo de prueba de 3-4 a 2 semanas.

Como unificado en Rusia se ha extendido, recomendado por el método de la quimioterapia Comité de la OMS de las concentraciones absolutas, que es desde un punto de vista metodológico, es la más sencilla, pero requiere una gran precisión y estandarización de los procedimientos de laboratorio. La prueba de sensibilidad a los medicamentos consiste en un conjunto de tubos de ensayo con un medio nutritivo modificado con medicamentos antituberculosos. El conjunto consta de 2-3 tubos con diferentes concentraciones de cada uno de los fármacos utilizados, tubos de uno de control sin fármaco para el medio ambiente y un tubo que contiene 1000 mcg / ml de sodio Sali tsilovokislogo o 500 ug / ml paranitrobenzoynoy no tuberculosas ácido para detectar el crecimiento de las micobacterias.

Para preparar un conjunto de medios con preparaciones, se utiliza un medio Levenstein-Jensen modificado (sin almidón), que se vierte en los matraces. En cada uno de los matraces, se agrega un volumen específico de dilución apropiada de la preparación antituberculosa. El contenido de los matraces se mezcla a fondo, se vierte en tubos y se pliega en una posición inclinada durante 40 minutos a una temperatura de 85ºC. Se recomienda enrollar el medio en una rebobinadora eléctrica con control de temperatura automático. Miércoles con medicamentos antituberculosos

La serie 1ª se puede almacenar en el refrigerador a 2-4 ° C durante 1 mes, con preparaciones de la segunda fila, no más de 2 semanas. El almacenamiento de medios con preparaciones a temperatura ambiente es inaceptable. Al preparar soluciones de fármacos antituberculosos, se tiene en cuenta su actividad, calculando la concentración ajustada para el peso molecular de la parte no específica de la preparación, pureza, etc. Para determinar la sensibilidad del medicamento, solo se utilizan sustancias químicamente puras.

El principio del método es determinar la concentración de un fármaco antituberculoso que inhibe el crecimiento de una parte significativa de la población de micobacterias. Si se hace correctamente, este método tiene una buena fiabilidad.

Antes de la prueba, es necesario asegurarse de que el cultivo aislado de Mycobacterium tuberculosis no tenga microflora extraña. A partir del cultivo de micobacterias en solución de cloruro sódico al 0,9%, se prepara una suspensión homogénea que contiene 500 millones de cuerpos microbianos por ml (estándar de turbidez óptica de 5 unidades). La suspensión espesa resultante se diluye con solución de cloruro sódico al 0,9% (1:10) y se añaden 0,2 ml de suspensión a cada tubo del conjunto de medios de cultivo. Los tubos sembrados se colocan en un termostato a 37 ° C y se mantienen en posición horizontal durante 2-3 días, de modo que la superficie inclinada del medio de cultivo se inocula uniformemente con la suspensión de Mycobacterium tuberculosis. Los tubos se transfieren a una posición vertical y se incuban durante 3-4 semanas. Los resultados se registran después de 3-4 semanas.

Dado que el tiempo de excreción excretoria del material clínico en los medios nutrientes es de al menos 1-1.5 meses, los resultados de determinar la sensibilidad del medicamento mediante este método pueden obtenerse no antes de 2-2.5 meses después de la siembra del material. Este es uno de los principales inconvenientes del método.

Interprete los resultados de determinar la sensibilidad a los medicamentos de las micobacterias sobre la base de ciertos criterios. En medios densos, se considera que el cultivo es sensible a la concentración del fármaco contenido en el medio si el número de colonias de micobacterias cultivadas en este tubo con el fármaco no supera 20, con crecimiento abundante en un tubo de control sin fármacos. Solo en presencia de más de 20 colonias se considera que el cultivo es resistente a esta concentración. En la práctica, al obtener resultados de crecimiento en tubos de ensayo cerca de 20 ufc. Es necesario notificar a la unidad clínica que la sensibilidad o resistencia en este caso es dudosa, ya que a veces puede explicar la dinámica difusa de los indicadores clínicos.

Para diversos fármacos se establece una cierta concentración, en la que se observa la reproducción de la proporción crítica de la población de micobacterias. Estas concentraciones se llaman "críticas". Como criterio de estabilidad, se usa el crecimiento de la población de micobacterias en un medio nutriente con una preparación a una concentración crítica.

En la práctica doméstica de TB, al determinar la resistencia a los medicamentos, no están limitados a determinar solo las concentraciones críticas. Esto es debido al hecho. Que el nivel de definición ampliada de la resistencia a fármacos permite al médico posicionar con mayor precisión la quimioterapia tácticas usando el conocimiento de potenciar la acción de las combinaciones de fármacos, Entrecruzado resistencia esperada o para aplicar un grupo fármacos más eficaces utilizados fármacos anti-TB.

El método de concentración absoluta es el más simple, pero también es el más sensible a los errores cometidos cuando se realiza. Más confiable, especialmente en la determinación de la sensibilidad a los medicamentos de segunda línea, y común fuera de Rusia es el método de las proporciones. Tiene en cuenta las deficiencias del método de concentraciones absolutas, pero en la ejecución es más laborioso.

El método es muy similar al método de concentración absoluta. La preparación de tubos de ensayo con medicamentos se lleva a cabo de la misma manera. Como en el método de concentración absoluta. Sin embargo, la dosis de semilla de la suspensión de Mycobacterium tuberculosis se reduce en un factor de 10. Que elimina la frecuencia de la resistencia espontánea de algunas cepas de Mycobacterium tuberculosis a fármacos tales como Etambutol, protionamida, capreomicina. Como control, se usan 2 o 3 tubos con una dosis de semilla igual en los tubos de ensayo, diluidos sucesivamente 10 y 100 veces. El criterio de estabilidad es la proporción de crecimiento observado visualmente de mycobacterium tuberculosis. Para las drogas de la 1ª serie, el criterio de estabilidad es el exceso de crecimiento del 1% de la población inicial, para las drogas de la segunda fila, un aumento de 1 o más del 10% de la inicial, dependiendo de la concentración crítica elegida.

En 1997, un grupo de trabajo de la OMS y la Unión Internacional para la identificación de la tuberculosis buena resistencia a los medicamentos TB ha hecho ajustes a estos criterios, ofreciendo micobacterias resistentes considerado, que crece en los medios de huevo sólido de Lowenstein-Jensen en las siguientes concentraciones:

  • dihidroestreptomicina - 4 μg / ml;
  • isoniazida 0.2 μg / ml:
  • rifampicina 40 μg / ml:
  • Ethambutol - 2 μg / ml.

En 2001, se propusieron concentraciones críticas para los siguientes medicamentos de segunda línea (para una proporción crítica del 1%):

  • capreomicina - 40 mcg / ml;
  • protionamida - 40 mcg / ml;
  • kanamicina - 30 μg / ml;
  • viomicina - 30 mcg / ml;
  • cicloserina 40 μg / ml;
  • ácido aminosalicílico - 0.5 μg / ml;
  • ofloxacina - 2 μg / ml.

Los resultados del crecimiento se evalúan después de 4 semanas como preliminar y después de 6 semanas de cultivo, como el definitivo.

Para determinar la sensibilidad del medicamento a la pirazinamida, que se usa ampliamente en la quimioterapia moderna para la tuberculosis, la concentración crítica recomendada es de 200 μg / ml. Sin embargo, hasta ahora no existe un método generalmente aceptado para determinar la resistencia a este fármaco en medios nutritivos sólidos, ya que su actividad antibacteriana se manifiesta solo en un medio ácido (pH <6), que es técnicamente difícil de mantener. Además, muchos cultivos clínicos de micobacterias tuberculosis crecen a regañadientes en entornos de huevos con un ambiente ácido.

Para evaluar la calidad de los resultados de determinar la sensibilidad a las drogas de las micobacterias, se recomienda que cada nuevo lote del medio de Levenstein-Jensen se controle mediante una determinación paralela de la sensibilidad de la cepa estándar del museo H37Rv. Además, existen ciertos criterios microbiológicos que deben mantenerse para que las técnicas den un resultado bien reproducible y correctamente interpretado. Estos incluyen la viabilidad del cultivo de Mycobacterium tuberculosis, las reglas para obtener una suspensión y suspensión homogénea, las reglas para seleccionar cultivos de Mycobacterium tuberculosis, la representatividad de la masa bacteriana seleccionada. La confiabilidad de la determinación de la resistencia a los medicamentos disminuye con una liberación bacteriana extremadamente escasa.

Recientemente, se ha considerado prometedor un método para determinar la sensibilidad a los medicamentos utilizando sistemas automáticos. Los más perfectos en esta área son los desarrollos basados en VASTES MGIT-960. En este caso, la sensibilidad a los medicamentos de Mycobacterium tuberculosis se determina sobre la base de un método de proporciones modificado. En el proceso de determinación, se compara la tasa de crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en un tubo de control y en tubos de ensayo con fármacos. Para determinar la sensibilidad a estreptomicina, isoniazida, rifamp-picina y etambutol, se usan suplementos de enriquecimiento y antibióticos incluidos en el kit SIRE. Para determinar la sensibilidad a pirazinamida, use el kit PZA. En el curso de tubos de ensayo de suspensión de Mycobacterium tuberculosis prueba inoculadas con medicamentos, así como los tubos de control con la suspensión reconstituida 100 veces para todos los fármacos excepto pirazinamida, en el que la suspensión es la dilución de 10 veces. El criterio de estabilidad es el indicador de crecimiento de micobacterias de 100 GU cuando se logra crecimiento en el tubo de control 400 GU (ver "Métodos de cultivo para aislar micobacterias"). La contabilidad y la interpretación de los resultados se llevan a cabo automáticamente y se establecen mediante la entrada o el programa seleccionado.

Como concentraciones críticas, las concentraciones finales se usan en un tubo de ensayo con un medio nutriente líquido. En la actualidad, se han desarrollado concentraciones críticas para los medicamentos de primera y segunda línea. Cabe señalar que la sensibilidad de la micobacteria tuberculosis a la cicloserina y al ácido aminosalicílico se determina únicamente en los medios nutrientes de huevo.

Un protocolo de trabajo detallado sobre el sistema descrito permite estudiar la susceptibilidad del fármaco tanto en un cultivo aislado (con un medio nutriente denso) como utilizando el crecimiento primario de micobacteria en un tubo MGIT. Esta última opción reduce significativamente el tiempo para la cultura, que le permite obtener los resultados completos de la cultura de Mycobacterium tuberculosis (incluida la información sobre la sensibilidad al fármaco) después de 3 semanas a partir de la fecha de recogida del material, mientras que el método tradicional, es posible obtener sólo el 3er mes. Con el tiempo, los resultados obtenidos, cuando el paciente está en una fase intensiva de tratamiento, pueden compensar el costo relativamente alto de la investigación.

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Diferenciación de micobacterias

Teniendo en cuenta que los medios nutrientes utilizados no son estrictamente selectivos. La diferenciación posterior de las micobacterias aisladas se reconoce como obligatoria. La necesidad para la diferenciación de micobacterias se debe a una serie de características de los procesos patológicos causados por el género: curso diferente y el resultado de la tuberculosis y micobacteriosis, la presencia de resistencia a la droga natural a algunos fármacos anti-TB.

Se reconoce que la identificación primaria de complejo Mycobacterium tuberculosis M. No tuberculosas de micobacterias se realiza por las siguientes características: la tasa de crecimiento en medios sólidos de nutrientes, pigmentación, morfología de la colonia, la presencia de resistencia a los ácidos y el crecimiento óptimo de temperatura.

Desafortunadamente, no hay método de laboratorio único para diferenciar de manera fiable M. Tuberculosis micobacterias complejo a partir de otros bacilos ácido-resistentes, sin embargo la combinación de características descritas anteriormente con los resultados dados a continuación de una serie de pruebas bioquímicas permite la identificación de complejo de Mycobacterium tuberculosis con M. Probable que 95%

Para la diferenciación de Mycobacterium complejo M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii y otros) de las micobacterias de crecimiento lento utilizado pruebas bioquímicas básicas no tuberculosas que detectan la presencia de los síntomas siguientes:

  • la capacidad de producir ácido nicotínico (prueba de niacina):
  • actividad de nitrato reductasa;
  • catalasa termoestable;
  • crecimiento en medio con salicilato de sodio (1 mg / ml).

Como pruebas adicionales, también se puede usar el crecimiento en un medio que contiene 500 μg / ml de ácido paranitrobenzoico o 5% de cloruro de sodio.

Muchos laboratorios bacteriológicos identifican estos microorganismos solo a nivel del complejo, lo cual se debe a las capacidades limitadas de los laboratorios y a las capacidades metodológicas de los especialistas.

En la mayoría de casos, sin embargo, en la práctica para la diferenciación de M. Tuberculosis y M. Bovis es suficiente las siguientes pruebas: niacina, por la presencia de nitrato, el registro de presencia y crecimiento pirazinamidazy en medio que contiene 2 ug / ml hidrazida de ácido tiofeno-2-carboxílico. Se tiene en cuenta que las micobacterias del complejo M. Tuberculosis se caracterizan por el siguiente conjunto de caracteres:

  • crecimiento lento (más de 3 semanas);
  • temperatura de crecimiento en el rango de 35-37 o C;
  • ausencia de pigmentación (marfil);
  • marcado color ácido-rápido;
  • una prueba de niacina positiva;
  • una prueba positiva de nitrato reductasa;
  • ausencia de catalasa termoestable (68 ° C).
  • La ausencia de crecimiento en un medio de Levenstein-Jensen que contiene:
    • 1000 μg / ml de salicilato de sodio,
    • 500 μg / ml de ácido paranitrobenzoico,
    • 5% de cloruro de sodio:
  • crecimiento en presencia de 1-5 μg / ml de ácido tiofeno-2-carboxílico.

La relevancia de la diferenciación de micobacterias aisladas aumentará notablemente con el aumento en la frecuencia de registro de casos de VIH / SIDA asociados con tuberculosis o micobacteriosis. En la actualidad, no existe una certeza absoluta de la preparación de los laboratorios regionales prácticos para realizar correctamente este volumen de trabajo.

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Diagnóstico inmunológico de la tuberculosis

Hay una serie de fenómenos universales, drogas y pruebas inmunológicas que se encontraron originalmente con tuberculosis o en el modelo de la respuesta inmune a las micobacterias. Estos incluyen BCG y tuberculina, un fenómeno como la GZT cutánea (pruebas de tuberculina - reacciones de Pirke y Mantoux), una reacción a la inyección subcutánea de tuberculina a un animal sensibilizado (fenómeno de Koch). Uno de los primeros anticuerpos en enfermedades infecciosas también se detectó en la tuberculosis. Por supuesto, cuanto más profunda es la comprensión de los mecanismos de inmunidad antituberculosa y su control genético, más amplio puede ser el uso de métodos inmunológicos y drogas que afectan la inmunidad para resolver los problemas prácticos de la ftisiología.

El problema práctico más importante y difícil actualmente se considera la detección de la tuberculosis en el proceso de detección masiva de la población. Sin embargo, a pesar de los numerosos informes de "éxitos" (en material limitado), no existe un método inmunológico adecuado (reproducible en "cualquier brazo") y el medicamento.

Los métodos inmunológicos, en particular los estudios serológicos (determinación de antígenos, anticuerpos) y las pruebas que provocan la tuberculina, se usan ampliamente en la práctica clínica.

En primer lugar, entre los estudios inmunológicos utilizados en el diagnóstico diferencial, existen métodos serológicos: la determinación de antígenos y anticuerpos en diferentes entornos del cuerpo.

La especificidad de los anticuerpos contra la micobacteria tuberculosis depende de los antígenos utilizados en el inmunoensayo. Se propone una cantidad significativa de antígenos, el primero de los cuales es la PPD de la tuberculina:

  • PAP y otras preparaciones complejas del líquido de cultivo;
  • desintegración ultrasónica;
  • Extracto de tritón y otras preparaciones complejas de paredes celulares;
  • 5-antígeno (Daniel);
  • 60-antígeno (Coccito);
  • lipoarabinomanano;
  • cord-factor (trehalosa-6,6-di-mycollate);
  • fenólico y otros glicolípidos;
  • lipopolisacáridos;
  • antígeno de unión a fibronectina;
  • proteínas (más a menudo recombinantes); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA, etc.

Como resultado de años de investigación por científicos rusos y extranjeros han puesto de manifiesto las leyes básicas y la eficacia del diagnóstico serológico de anticuerpos de la tuberculosis: el antígeno más compleja, la mayor sensibilidad y una menor especificidad de la prueba. Especificidad en diferentes países varía dependiendo de la población de la infección por M. Tuberculosis y micobacterias no tuberculosas de la realización de la vacunación BCG y otros. En los niños, el contenido de información de diagnóstico serológico es menor que en los adultos. En la tuberculosis primaria (más a menudo en niños), la definición de IgM es más informativa. Con IgG secundaria. En pacientes infectados por VIH, se reduce el valor informativo del serodiagnóstico para determinar anticuerpos. Determinación Eficiencia de anticuerpos depende de la cantidad de "aspectos clínicos": actividad de proceso (la presencia o ausencia de la presencia decaimiento "aislamiento" micobacterias de cavidades, el grado de infiltración), la prevalencia del proceso, la duración de su flujo.

La sensibilidad del método de inmunoensayo enzimático (ELISA) es de alrededor del 70%. La efectividad insuficiente del estudio se debe a su baja especificidad. Previamente, se consideró la posibilidad de utilizar el cribado serológico en grupos de alto riesgo, en particular entre las personas con cambios post-tuberculosis en los pulmones.

Para aumentar la especificidad de ELISA, continúe la búsqueda de antígenos más específicos, incluidos los obtenidos mediante ingeniería genética: ESAT-6, etc. (ver arriba). El uso de antígenos estrictamente específicos (38 kDa, ESAT) aumenta la especificidad. Pero reduce significativamente la sensibilidad del análisis. Junto con IFA (sistemas de pruebas de laboratorio experimental. P. Ej kit Pathozyme ELISA) también proporciona kits con filtración lateral inmunocromatográfica (Mycodot), así como otras pruebas similares (dot-análisis en la membrana) con una evaluación visual del resultado de la prueba. Durante estas pruebas, el análisis se lleva a cabo durante 10-30 minutos; no requieren equipos especiales, requieren una evaluación visual de los resultados, que está asociada con una cierta subjetividad. Estos métodos tienen aproximadamente las mismas características de sensibilidad y especificidad (70% y 90-93%, respectivamente) que el ELISA tradicional.

El uso de métodos de análisis inmunológico tiene un valor definido como adicional, tomado en cuenta en el complejo de métodos utilizados, en el diagnóstico diferencial de la tuberculosis, especialmente en el diagnóstico de sus formas extrapulmonares. El método de ELISA más efectivo está en el diagnóstico de la meningitis tuberculosa en el estudio del líquido cefalorraquídeo. En este caso, la sensibilidad del análisis es 80-85% y la especificidad es 97-98%. Existen datos sobre la efectividad de la detección de anticuerpos contra micobacterias tuberculosis en el fluido lagrimal en el diagnóstico de uveítis tuberculosa.

Inducción de la síntesis de interferón gamma in vitro

El interferón gamma (IFN-γ) es un factor de defensa inmunitario específico que se realiza activando los sistemas de enzimas macrófagas. La inducción de la síntesis de IFN-γ por los linfocitos T sensibilizados causa su interacción con los antígenos de las micobacterias.

Como antígenos utilizados como tuberculina PPD. Y antígenos específicos obtenidos genéticamente, en particular antígenos ESAT-6 (antígeno temprano secretado con un peso molecular de 6 kDa) y CFP-10 (una proteína de filtrado de cultivo, 10 kDa). La ingeniería genética o los antígenos recombinantes están ausentes en las células de la vacuna BCG y otras micobacterias. Cuando se utiliza la tuberculina, los resultados de la prueba de inducción IFN-γ son comparables con los resultados de la prueba cutánea de tuberculina (correlación directa). Cuando se usan antígenos genéticamente modificados, los resultados de las pruebas son más específicos y no dependen de la vacuna BCG previa. Al evaluar a las personas vacunadas que no tuvieron contacto con la infección tuberculosa, la especificidad de la prueba es del 99%. La sensibilidad de la prueba entre los pacientes con tuberculosis varía de 81 a 89%.

Las pruebas y herramientas de diagnóstico se han desarrollado basada en el cultivo a corto plazo de las células o células mononucleares de sangre entera aislados de la sangre con antígenos de Mycobacterium tuberculosis in vitro con determinación posterior de la concentración de IFN-γ o contando el número de linfocitos T que sintetizan IFN-γ. La concentración de interferón sintetizado en un tubo de ensayo se determina mediante ELISA usando anticuerpos monoclonales que se unen a IFN-γ. Luego, calibrando el estándar IFN-γ, su concentración se determina en el tubo de ensayo o en los pocillos de la placa.

Al realizar la prueba de Elispot, la cantidad de T-limocitos que sintetizan IFN-γ. Se cuentan en la superficie de una placa recubierta con anticuerpos contra IFN-γ.

Los desarrolladores de diagnosticum sobre la base de la inducción de IFN-γ in vitro, que está aprobado por la Agencia de Medicamentos y Productos de los Estados Unidos, argumentan que es imposible diferenciar la infección tuberculosa latente de la tuberculosis activa con la ayuda de la prueba. Por lo tanto, en regiones con un alto nivel de infección, la prueba no es directamente diagnóstica. Sin embargo, en nuestro país se puede utilizar para diferenciar la infección tuberculosa en niños de la alergia posterior a la vacunación, y para evaluar el nivel de inmunidad específica en el proceso de tratamiento.

En la actualidad, se está estudiando el sistema de prueba doméstico para determinar la inducción de la síntesis de IFN-γ por antígenos de tuberculosis específicos in vitro.

Estado inmune y evolución de la tuberculosis, inmunocorrección

En el proceso de tratamiento de la tuberculosis en humanos, hay cambios en la antigenemia y el estado del sistema inmune.

Los datos sobre los cambios en los exudados y los tejidos son en gran parte contradictorios. Lo único que se puede observar con buena razón es que en granulomas tuberculares, como regla general, se detecta un número significativo de linfocitos T activados.

Tiene sentido detenerse en dos disposiciones más que son necesarias para comprender el papel de los mecanismos inmunológicos en el tratamiento de la tuberculosis en humanos:

  • Los pacientes con SIDA tienen una incidencia particularmente alta de resistencia a múltiples fármacos;
  • con resistencia a múltiples fármacos (y en ausencia de infección por VIH), los trastornos de inmunidad (especialmente el enlace de células T) son particularmente significativos.

Cuando tuberculosis ampliamente aplicar varios métodos de inmunomodulación: es principalmente fármacos que actúan principalmente sobre la inmunidad de células T y un sistema de fagocitos mononucleares (hormonas tímicas, isoforona, likopid, polioksidony et al.). Así como las micobacterias enteras (atenuadas) y sus componentes.

Diagnóstico molecular y biológico de la tuberculosis

Para los métodos de biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas incluyen, principalmente, los métodos basados en la manipulación con el material genómico de patógenos bacterianos y virales para identificar el material genético específico - segmentos de ADN que tienen una secuencia de nucleótidos específica para un tipo o patógeno particular cepas para analizar específica Secuencias de ADN en genes que determinan la sensibilidad del patógeno a ciertas sustancias medicinales, y también para el análisis funcional actividad de ciertos genes del patógeno. Técnicas de biología molecular eran ampliamente en la investigación científica y aplicación práctica en el diagnóstico y seguimiento de diversas infecciones bacterianas y virales después de la apertura en 1985, Carrie Myullisom (ganador del premio Nobel. 1989) reacción en cadena de la polimerasa.

Principios y posibilidades del método de reacción en cadena de la polimerasa

La PCR permite amplificar (multiplicar) in vitro una secuencia de nucleótidos (fragmento de ADN del patógeno) durante varias horas en millones de veces. La reacción en presencia de cadenas de ADN individuales determina la sensibilidad extremadamente alta del ensayo.

La secuencia de nucleótidos de ciertas regiones en la cadena de ADN determina la identidad genética del microorganismo, lo que explica la alta especificidad de la PCR.

El valor de esta técnica para la detección e investigación de las características causadas por Mycobacterium tuberculosis características biológicas de un microorganismo que tiene un crecimiento muy lento: tiempo de ADN de Mycobacterium tuberculosis doblar cuando el cultivo es de 12-24 horas.

El principio del método de PCR consiste en la amplificación: múltiples, millones de veces. Multiplicar las secciones de una secuencia de ADN específica en un microvolumen tubular durante una recurrencia cíclica de las siguientes tres etapas de reacción, cada una de las cuales pasa en un régimen de temperatura diferente:

  • Etapa I - desnaturalización del ADN bicatenario al calentar con una divergencia de sus cadenas;
  • Etapa II - unión complementaria (hibridación) de cebadores (oligonucleótidos cebadores) con secciones terminales de cadenas estrictamente específicas, elegidas para la multiplicación del fragmento de ADN;
  • Etapa III - finalización de la cadena del fragmento de ADN usando una ADN polimerasa termoestable.

Para la amplificación in vitro, debe haber moléculas de ADN matricial. Cuatro tipos de desoxinucleósido trifosfatos (nucleótidos) que contienen las bases nitrogenadas correspondientes: adenina (A), timina (T), guanina (D), citosina (C); oligonucleótidos cebadores sintetizados artificialmente (cebadores) que consisten en 18-20 pares de bases; enzima de ADN polimerasa termoestable que tiene un óptimo de temperatura de 68-72 en la C, y los iones de magnesio.

La especificidad de la PCR depende de la elección del fragmento de ADN. De acuerdo con esto, se sintetizan oligonucleótidos de semilla de flanco. La especificidad de la hibridación y la terminación de la cadena de ADN se debe al principio de complementariedad de los siguientes pares de bases nitrogenadas: adenina-timina, guanina-citosina.

Para determinar el complejo genómico tuberculosa micobacterias amplificación de la diana más eficiente en la mayoría de sistemas de ensayo elegidas fragmento de ADN de IS6110, que en la mayoría de cepas de genoma de Mycobacterium tuberculosis tiene un número significativo (10-20) de repeticiones, que proporciona, junto con la especificidad, alta sensibilidad del ensayo. Al mismo tiempo, se describen cepas de Mycobacterium tuberculosis con un pequeño número de repeticiones o la ausencia del fragmento IS6110.

Aislamiento de moléculas de ADN de una muestra biológica

Para llevar a cabo la PCR, las moléculas de ADN del patógeno deben aislarse del material biológico en un volumen mínimo, con una cantidad mínima de ADN no específico y diversos inhibidores de la enzima-ADN polimerasa.

La preparación de las muestras debe llevarse a cabo en condiciones que impidan la contaminación cruzada de las muestras por las moléculas de ADN aisladas. Para hacer esto, es necesario pretratar la habitación con ultravioletas, pisos y superficies de trabajo de escritorios y electrodomésticos con soluciones que contengan cloro. También es obligatorio el uso de guantes limpios, tubos de prueba desechables y puntas para pipetas automáticas.

Para aislar el ADN de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras clínicas (líquido cefalorraquídeo, lavado bronquial) que no contiene un gran número de células, restos celulares, o sales de los mismos, suficiente para centrifugar la muestra a 3-4 mil. Rpm, añadir a la solución de lodos 20-30 ul de 2% Triton X-100 y se calentó a 90 sobre C durante 30 min.

Para la preparación de muestras de esputo, es necesaria una dilución efectiva, para la cual una solución de hidróxido de sodio al 4% y N-acetil-L-cisteína (NALC) se usan generalmente en una cantidad de 50-80 mg por muestra, dependiendo de la viscosidad de la muestra. La solución NALC debe prepararse ex tempore o el polvo NALC se puede agregar seco a la muestra directamente. Después de la licuefacción, las muestras deben centrifugarse durante 15 minutos a 3.5-4.000 rpm (3000 g) en viales de 50 ml con tapones de rosca, i. E. En las mismas condiciones que se recomiendan para la preparación previa de la flema.

Para la extracción de ADN a partir del método de pellets se utiliza más a menudo basado en el uso de una solución de 5-6 molar de reactivo de lisis de isotiocianato de guanidina como las partículas microporosas y óxido de silicio ( "tierra de diatomeas") de sorción molécula de ADN. Sustancias no específicas, incluyendo inhibidores posibles, después se lavó en una solución 2,5 molar de isotiocianato de guanidinio y solución de etanol, después de lo cual la molécula de ADN se desorbe en agua, y estas muestras se utilizaron para realizar la PCR. Para simplificar la tecnología de extracción de ADN, la "tierra de diatomeas" a menudo se reemplaza por micropartículas magnéticas recubiertas con óxido de silicio. En este caso, se usa un soporte magnético especial para microtubos en lugar de la centrifugación para precipitar las partículas.

En Rusia, se desarrolló un método original para la separación inmunomagnética de micobacterias, seguido de la extracción del ADN del patógeno. Para Mycobacterium tuberculosis separación inmunomagnética usando tamaño ferroparticles de 3-5 micrómetros, recubierta con sílice, a la que están unidos por enlaces químicos policlonal (conejo) anticuerpos frente a Mycobacterium tuberculosis. Las muestras de esputo después de la lisis alcalina se neutralizan con una solución ácida de tris-HCl y se incuban con un sorbente inmunomagnético. Luego, las inmunoferropartículas se recogen con una varilla magnética con una punta reemplazable, se transfieren a un microtubo y se precipitan. Añadir 20-30 μl de una solución de Triton X-100 al 2% y calentar durante 30 minutos a 90 ° C. El sobrenadante se usa como plantilla de ADN para el análisis de PCR.

Un problema difícil es el aislamiento del ADN de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de biopsia. Para la biopsia enzimática, la enzima proteinasa K se usa a una concentración final de 200-500 mg / l a una temperatura de 56 ° C durante la noche. Además, se usa uno de los métodos conocidos. El exceso de ADN inespecífico en el análisis de PCR de biopsias a menudo causa la inhibición de la reacción, que requiere la extracción repetida de ADN.

Métodos para detectar resultados

Una vez completada la reacción, los fragmentos de ADN amplificados del patógeno se identifican por diversos métodos.

El método de electroforesis en gel es bien conocido. El fragmento de ADN resultante se identifica mediante un control positivo que contiene el fragmento de ADN específico deseado, o según un tamaño conocido (el número de pares de nucleótidos) del fragmento, que se determina usando un marcador molecular estándar.

En presencia de un colorante específico, el bromuro de etidio se incluye en el ADN bicatenario. El fragmento de ADN sintetizado se detecta como una banda luminosa bajo la acción del ultravioleta.

El tamaño del fragmento de ADN, determinado por electroforesis desde la distancia desde el inicio, debe corresponder a un marcador de peso molecular conocido o control positivo.

Otros métodos de determinación de los resultados de PCR basados en la hibridación de una sola cadena de productos de PCR con un oligonucleótido complementaria a la misma - sonda de ADN marcado con biotina, seguido por la detección a través de reacciones enzimáticas, por ejemplo mediante la unión a la fosfatasa alcalina de estreptavidina-biotina.

En base a este tipo de detección, se han creado analizadores de PCR en los que la detección de los resultados de la PCR se lleva a cabo automáticamente como resultado de la lectura de la densidad óptica en las muestras después de la manifestación de la reacción enzimática.

Las desventajas de estos métodos son las posibilidades de contaminación intralaboratorio por fragmentos bastante cortos de moléculas de ADN. Cuando las moléculas ingresan nuevas muestras, se convierten en una matriz para la PCR y conducen a resultados falsos positivos.

En este sentido, para evitar resultados falsos positivos, se introducen reglas estrictas para la separación y el aislamiento de las instalaciones: extraer ADN de muestras biológicas; locales para la detección de resultados (electroforesis) de la zona limpia. Estas premisas son una zona de contaminación probable. Otra área aislada es una sala limpia para introducir las muestras de ADN que se analizarán en tubos con una mezcla de reacción para PCR. Finalmente, se supone que el dispositivo principal, el amplificador de ADN, debe colocarse en una habitación separada, posiblemente de oficina.

Para evitar la contaminación de los productos de las reacciones anteriores - algunos de prueba del sistema Likon-amp PCR en lugar dezoksinukleozidtimidina contiene dezoksinukleoziduridin que, cuando el circuito de síntesis in vitro incorpora en vez en la posición correcta, es decir, La base nitrogenada de timina presente en el ADN nativo se reemplaza por uracilo. Uracilo DNA glicosilasa se añade a la mezcla de reacción con el analito, destruye sólo fragmentos contaminantes desoxiuridina, pero no nativa de ADN se analizó. Lt; / RTI & gt; El calentamiento posterior a 94 ° C inactiva esta enzima y no interfiere con la amplificación en la PCR.

Hay un sistema de prueba basado en la amplificación isotérmica de ARNr, para lo cual se lleva a cabo primero la transcripción inversa y la síntesis de moléculas de ADN. Que, a su vez, es una matriz para la síntesis posterior de moléculas de ARN. Los amplicones de ARN se detectan utilizando una sonda de ADN teñida con acridina cuando se hibridan en una solución de tubo de reacción. Este método, además de alta sensibilidad, tiene la ventaja de analizar en un tubo, lo que evita la contaminación. Según los autores, la sensibilidad de este método en muestras respiratorias alcanza el 90% con una especificidad del 99-100%.

Se implementan nuevos métodos de detección en PCR en tiempo real. Estos métodos difieren principalmente en que la PCR y la detección de sus resultados se llevan a cabo simultáneamente en un tubo cerrado. Esto no solo simplifica tecnológicamente la técnica de análisis, sino que también evita la contaminación de las salas de laboratorio y muestras de prueba con productos de PCR previa.

Con la PCR en tiempo real, la detección de los resultados se debe a la fluorescencia que surge de la hibridación de una sonda de ADN fluorogénico con un fragmento específico de ADN amplificado durante la PCR. Estructura de sondas de ADN fluorogénicos construidos de manera que el marcador fluorescente se libera como resultado de la reacción enzimática o distanciado de la fluorescencia molécula de extintor sólo bajo la hibridación específica con la molécula de ADN deseada que va a amplificarse durante la PCR. Con el aumento en el número de moléculas hibridadas con la sonda, el aumento de la fluorescencia hasta el nivel detectable es proporcional al número de moléculas del producto amplificado. Dado que en cada número de ciclo de PCR molécula de fragmento de ADN se multiplica por medio, el ciclo en el cual se determina la fluorescencia y aumenta inversamente proporcional al número de moléculas de ADN en la muestra inicial. Si la reacción es introducir como calibrador varias concentraciones conocidas diferentes de moléculas fragmento de ADN de Mycobacterium tuberculosis correspondientes, utilizando el programa de ordenador puede ser calculada y la cantidad de ADN genómico en el material de ensayo.

Cada muestra estándar está duplicada. El criterio cuantitativo es el número mínimo de ciclos de PCR necesarios para el inicio y el crecimiento de la fluorescencia determinada. En la abscisa - el número de ciclos; la ordenada es el valor de fluorescencia. Las concentraciones de ADN son inversamente proporcionales al número de ciclos requeridos para la aparición de fluorescencia. En la columna de la derecha (21-32), se marcan los números de ciclo para las concentraciones correspondientes. Diferencias entre concentraciones 10 veces mayores de fragmentos de ADN 10 2 -10 6 ml - 3.2-3.4 ciclos. Para dos pacientes, las concentraciones de fragmentos de IS6110 fueron aproximadamente 10 3 / ml y 10 4 / ml. Teniendo en cuenta el número de repeticiones (6-20) de los fragmentos analizados en el genoma de Mycobacterium tuberculosis, el número de micobacterias en muestras clínicas es de aproximadamente 100 y 1000 células, respectivamente.

El uso de PCR en el diagnóstico de tuberculosis

El método de PCR es el más utilizado para el diagnóstico acelerado de la tuberculosis - detección de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas: esputo. Enrojecimiento bronquial, exudado pleural, orina, líquido cefalorraquídeo, osteólisis punteada, aspirados del tracto genital femenino y varias muestras de biopsia. Al estudiar alrededor de 500 muestras de esputo y bronquiales de 340 pacientes con diagnóstico confirmado de tuberculosis pulmonar en los Países Bajos, se estudió la sensibilidad comparativa de PCR, cultivo y microscopía de frotis. La sensibilidad del análisis fue 92.6.88.9 y 52.4%, respectivamente. La especificidad de todos los métodos fue de aproximadamente el 99%.

Se comparó la efectividad de la detección de Mycobacterium tuberculosis mediante microscopía de frotis, la siembra en el medio de Levenstein-Jensen, el sistema de prueba VASTES y el análisis de PCR. PCR mostró una sensibilidad de 74.4%, microscopía - 33.8%, siembra en un medio denso - 48.9% y VASTES - 55.8%. El tiempo de detección promedio para la siembra en un medio de Levenstein-Jensen es de 24 días. VASTES - 13 días, PCR - 1 día.

También se discuten las posibilidades de utilizar PCR como un método sensible y rápido para controlar la efectividad del tratamiento de la tuberculosis.

Detección de ADN de Mycobacterium tuberculosis por PCR con quimioterapia efectiva determinada durante un tiempo más largo - en promedio 1,7 meses en comparación con los frotis se define en la microscopía de fluorescencia, y de 2,5 meses en comparación con el examen bacteriológico.

Diagnóstico de formas extrapulmonares de tuberculosis

El significado de la PCR como método sensible es especialmente bueno para las formas extrapulmonares, ya que es con estas formas que los métodos clínico-radiológicos y los métodos bacteriológicos tradicionales para determinar las micobacterias de la tuberculosis en los materiales de diagnóstico son ineficaces.

En la investigación de muestras de orina resultados de la PCR fueron positivos en 16 de 17 pacientes con TB activa y urinario negativo 4 pacientes tuberculosis renal inactivo y 39 pacientes con no tuberculosas enfermedad del sistema urinario.

La efectividad del análisis de PCR en el estudio de aspirados de médula ósea en pacientes con fiebre de origen desconocido se demostró en casos de sospecha de tuberculosis. Para el diagnóstico de linfadenitis tuberculosa, se estudiaron 102 aspirados de punción y una muestra de biopsia de 67 niños con sospecha de linfadenitis tuberculosa en niños. Se obtuvieron resultados positivos: 71.6% de PCR en tiempo real. Microscopía de fluorescencia: 46,3%. Investigación cultural - 41,8%. En el estudio de 50 biopsias de ganglios linfáticos en pacientes con enfermedad por "arañazo de gato", todos los resultados fueron negativos. Por lo tanto, se demostró una especificidad del 100% del análisis de PCR. En el mismo trabajo, con biopsia por punción de ganglios linfáticos, se demostró la posibilidad de detección de M. Avium.

El diagnóstico de la tuberculosis en la infertilidad del área genital femenina, como es sabido, es uno de los problemas más difíciles del diagnóstico. En un estudio de PCR de biopsias endometriales, aspirados endometriales y muestras de líquido del espacio Douglas, 14 (56%) de 25 pacientes examinados laparoscópicamente con sospecha de tuberculosis recibieron resultados positivos. Usando microscopía de frotis y cultivo, se obtuvieron 1 y 2 resultados, respectivamente. Estos casos también fueron positivos para PCR. La mayoría de los resultados positivos para PCR se relacionaron con casos con signos característicos de tuberculosis según el estudio histológico; un número más pequeño - con sospecha de tuberculosis según los datos de la laparoscopia. Solo se obtuvo un resultado positivo del análisis de PCR en ausencia de datos laparoscópicos para la tuberculosis.

Al diagnosticar formas extrapulmonares de tuberculosis, los médicos a menudo tienen una pregunta sobre la posibilidad de detectar un patógeno cuando se analizan muestras de sangre con el método de PCR. Los datos literarios indican que la detección de ADN de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de sangre es posible con formas de gran alcance de infección por VIH. El ADN de Mycobacterium tuberculosis se detectó solo con tuberculosis generalizada de diversos órganos en pacientes con riñón trasplantado e inmunosupresión.

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Identificación de especies de micobacterias

El método de PCR puede ser bastante eficaz para la rápida identificación de micobacterias del complejo tuberculosis y algunas especies de micobacterias no tuberculosas después de recibir su crecimiento inicial. En este caso, el uso de PCR puede ahorrar de 7 a 10 días, necesario para la posterior identificación cultural de un resultado positivo. La prueba de PCR es técnicamente muy simple, ya que no requiere una preparación de muestras complicada del material clínico para lograr una alta sensibilidad. En el estudio de 80 positivo en este sistema de prueba (empresa MB Vasto. Organon) todos los cultivos positivos de PCR fueron estrictamente específico y se mantuvo durante 1 día. Para identificar otras especies de micobacterias en la preparación de ADN de la cultura patógeno se hibridaron con sondas de ADN específicas marcadas con acridina y cepas detectadas por la aparición de quimioluminiscencia por medio de tiras quimioluminómetro o de nitrocelulosa con una evaluación visual después de la hibridación. Con la ayuda de dicho conjunto, se identifica un número limitado de especies: el complejo Mycobacterium tuberculosis. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii y M. Gordonae.

A.Telenti et al. También desarrollado un método relativamente simple y barato de la identificación de especies de especies clínicamente importantes de micobacterias por PCR y posterior tratamiento con dos enzimas de restricción (enzimas que tienen propiedades cortan una molécula de ADN en puntos específicos). El fragmento de ADN se amplifica. Que codifica una proteína de choque térmico (65 kDa), y después se trató en el fragmento de ADN de PCR resultante de 439 pares de nucleótidos por separado dos enzimas - BstE II y Hae III. Después se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa obtenerse dos productos, la determinación de su tamaño (número de pares de bases) utilizando un conjunto estándar de fragmentos de ADN (marcadores de DNA moleculares) de longitud de 100 a 1000 pares de bases. En cada uno de los tipos específicos (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M. Fortuitum) detectar dos o tres fragmentos de ADN de diferente tamaño para cada enzima de restricción. La combinación de diferentes tamaños de fragmentos de ADN permite diferenciar estas especies entre sí.

La tecnología de microarrays de ADN biológico se está desarrollando. Lo que ayudará a identificar más de 100 especies de micobacterias en un estudio.

La identificación de especies también puede llevarse a cabo mediante la amplificación por PCR de la región variable 16S rRNA seguida de la secuenciación de amplicones cuando se compara con la estructura primaria correspondiente, que permite identificar más de 40 especies de micobacterias.

Con la ayuda de PCR, también se puede llevar a cabo una identificación de especies dentro del complejo Mycobacterium tuberculosis, incluida la diferenciación de M. Bovis y M. Bovis BCG. Para ello, se analiza la presencia o ausencia de algunos genes en las regiones genómicas de RD1. RD9 y RD10. RD1 está ausente en M. Bovis BCG, pero está presente en especies virulentas, incluyendo M. Bovis.

Determinación de la sensibilidad a los medicamentos de Mycobacterium tuberculosis mediante PCR

Objetivos de métodos de genética molecular para susceptibilidad a fármacos o resistencia de Mycobacterium tuberculosis reducen para identificar mutaciones en secuencias de nucleótidos específicas de los genes conocidos. Los métodos básicos se basan ya sea en prochityvanii directa (secuenciación) de estas secuencias después de la amplificación o hibridación de fragmentos de ADN marcados con biotina amplificados durante las sondas de ADN PCR. Ambas alternativas implican la identificación de las sustituciones de nucleótidos en las secuencias que utilizando sondas de ADN conducen a la ausencia o la hibridación incompleta a una membrana de nitrocelulosa utilizando el conjugado de enzima (estreptavidina-fosfatasa alcalina) - Método LIPA-Rif-TB.

Método para medir la fluorescencia en un fijado localmente en microsecciones ADN sondas complementarias a mutaciones conocidas en las regiones de genes amplificados por PCR responsables de la resistencia o sensibilidad a los fármacos, llamados mikrobiochipov método. El algoritmo principal para llevar a cabo esta investigación es el siguiente. Después de aislar ADN de una muestra clínica o cultivo de micobacterias es necesario llevar a cabo la amplificación por PCR de los fragmentos pertinentes del gen rpoB responsable de la sensibilidad al fármaco a la rifampicina o genes katG y INHA que codifican las proteínas de Mycobacterium son responsables de la sensibilidad a la isoniazida. Los resultados de PCR se evalúan mediante electroforesis en gel de agarosa, en la que se confirman los fragmentos de ADN correspondientes de la longitud deseada. Luego, se realiza una segunda ronda de PCR para introducir una etiqueta fluorescente en el ADN. Los resultados de la PCR se confirman nuevamente mediante electroforesis en gel. A partir de entonces, la hibridación se llevó a cabo (incubación durante la noche), seguido de lavado del material resultante en el biochip, que es un gran número de fijo en una pequeña placa de vidrio hebras cortas de ADN (sondas) que son complementarios a secuencias de nucleótidos de la tuberculosis tipo Mycobacterium sensible a los fármacos en los puntos de posibles mutaciones. Así como a las secuencias mutantes responsables de la resistencia a los medicamentos. La ubicación de las sondas de ADN en la placa está estrictamente definida, y el nivel de la fluorescencia observada durante la hibridación se determina para determinar el resultado por medio de un lector especial. En este sentido, los resultados del análisis se determinan por medio de un programa informático especial.

En los últimos años, se han desarrollado métodos alternativos para determinar la sensibilidad a los medicamentos de las micobacterias tuberculosis sobre la base de la tecnología de PCR en tiempo real, lo que permite realizar estos estudios en una prueba de tubo cerrado.

En la Fig. 13-13 presenta el resultado del análisis de cultivos clínicos de Mycobacterium tuberculosis en la determinación de la resistencia a fármacos a la rifampicina mediante PCR en tiempo real: 218 - una muestra de control (sensible a la rifampicina); 93 - control positivo para la mutación de Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - control positivo para la mutación de Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - muestras experimentales. Resultado del cálculo de las curvas cinéticas de amplificación en 4 canales: canal 1: 393 - control positivo para la mutación de Ser-Trp TCG-TGG; canal 2: 4482 - control positivo para la mutación de Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - muestras experimentales; canal 4: curvas cinéticas de amplificación de todas las muestras que participan en el experimento. Control positivo de la reacción de amplificación. Conclusiones: En base a los resultados del análisis, se identificaron las siguientes mutaciones que determinan la resistencia a la rifampicina: en las muestras 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. El mismo principio se usó para determinar la resistencia a los medicamentos a la isoniazida para los genes katG e inhA, que determina las mutaciones más frecuentes.

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Identificación de la cepa de Mycobacterium tuberculosis

El método más estudiado de la identificación de cepas de Mycobacterium tuberculosis es una técnica llamada de restricción de longitud de fragmentos polimórficos (RFLP RFLP,. O en la versión Inglés) y que se basa en fragmentirovanin (restricción) de la enzima de ADN de Mycobacterium tuberculosis Pvu II y los fragmentos obtenidos de hibridación posterior con ciertas secuencias específicas en el ADN su elemento repetido IS6110. La variabilidad intraespecífica se realiza debido a la diferente cantidad de repeticiones de IS6110 y su ubicación en el ADN. Así como también la variedad de distancias entre ciertos puntos de ataque de enzimas de restricción enzimática (sitios de restricción) y el elemento IS6110. Esta tecnología es muy complicada y lleva mucho tiempo. Después del tratamiento con ADN extraído de un cultivo de Mycobacterium tuberculosis, electroforesis en gel se realiza con una enzima de restricción, y luego se transfiere fragmentos de ADN de diferentes longitudes en una membrana de nitrocelulosa, la hibridación se llevó a cabo con fragmentos de IS6110-elemento y se detecta por medio de reacciones enzimáticas. El patrón específico resultante de bandas caracteriza el ADN de una cepa específica de Mycobacterium tuberculosis. Con la ayuda del análisis por computadora, se revela la identidad o la relación de las tensiones. A pesar de que el método RFLP es el más discriminatorio, es decir revela el mayor número de diferencias en las cepas analizadas, es ineficaz con un pequeño número (menos de 5) IS6110-repeticiones observadas en algunas cepas. En la Fig. 13-14 muestra los resultados de la tipificación RFLP de cepas.

Una alternativa puede ser el método de spoligotyping - análisis del polimorfismo de las secuencias de DNA espaciadoras - intermedio entre las repeticiones directas de la región DR. Al llevar a cabo la spoligotyping de las cepas, la PCR se lleva a cabo con cebadores que delimitan la región DR, después de lo cual se forman fragmentos de diferente longitud que se hibridan con las regiones intermedias variables de DNA. Se presenta el análisis de las secuencias espaciadoras de la región DR. Según los investigadores, más simple, productivo y adecuado para la detección primaria de cepas y el análisis epidemiológico preliminar, así como la investigación directamente material clínico.

Obviamente, el método más efectivo y accesible tecnológicamente es el VNTR (abreviatura de palabras en inglés), o el método para determinar el número variable de repeticiones en tándem exactas en el ADN de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa solo en el uso de PCR y no requiere manipulación adicional. Dado que el número de repeticiones en tándem en diferentes cepas y en diferentes loci es diferente, los fragmentos de diferentes tamaños se determinan y analizan en el electroforegrama resultante de los productos de PCR. Según los investigadores, el uso de VNTR logra un mayor grado de discriminación de cepas que con el método RFLP.

En los últimos años, se ha prestado mucha atención a la propagación de cepas de Mycobacterium tuberculosis de la familia W-Beijing (a veces llamada cepa de Beijing), que son en gran medida resistentes a los medicamentos.

Requisitos básicos para la calidad de la investigación en biología molecular

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Documentos normativos básicos para PCR

Órdenes del Ministerio ruso de Salud: №45 del 07/02/2000 g .. Número 109 de 21/03/2003 g .. Número 64 del 21/02/2000, las Directrices: 1.3.1888-04 "Organización de los trabajos en los estudios que utilizan material de PCR infectados con patógenos biológicos agentes de los grupos III-IV de patogenicidad "; 1.3.1794-03 "Organización del trabajo en el estudio de material de PCR, infectado con microorganismos de los grupos de patogenicidad I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "descontaminación del material, infectado bacterias I-IV Grupos de patogenicidad cuando se utiliza PCR," 2001 El apéndice 11 a las instrucciones unificados para los métodos de examen microbiológico en la identificación, diagnóstico y tratamiento de la tuberculosis.

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El personal

Ejecución de la investigación biológica molecular puede mantener los doctores de diagnósticos clínicos de laboratorio, médicos bacteriologists, virólogos, médicos, biólogos, laboratorio de diagnóstico clínico, así como especialistas con la educación médica secundaria, pasado especialización y formación avanzada en la forma prescrita.

Arreglo de locales de laboratorio

Se requieren las siguientes salas de laboratorio:

  • El área de manejo de muestras es un laboratorio adaptado para trabajar con agentes infecciosos de grupos de patogenicidad III-IV, de acuerdo con las Instrucciones Metódicas 13.1888-04.
  • Zona para la preparación de mezclas de reacción PCR - sala de laboratorio, que proporciona protección contra la contaminación interna del laboratorio - zona "limpia".
  • • Si se usa electroforesis o hibridación para analizar los productos de PCR. Sala de laboratorio en el que los fragmentos de ADN multiplicados se extraen de los tubos y de amplificación, respectivamente, pueden entrar en el medio ambiente, de acuerdo con los requisitos para los laboratorios de PCR (1.3.1794-03 Directrices, Orientación 1.3.1888-04) debe ser plenamente está aislado de las premisas indicadas en los párrafos anteriores. Debe ser excluido de la zona de movimiento a la zona de electroforesis para la manipulación de muestras y una zona de "limpia" de cualquier personal, el equipo, los materiales y objetos, así como la transferencia de aire a través del sistema de ventilación, o como resultado de corrientes de aire. Esta zona no es necesaria para la detección fluorimétrica de los productos de PCR.
  • La sala de documentación y procesamiento de resultados está equipada con computadoras y el equipo de oficina necesario. Esta sala puede contener equipos que proporcionan detección de productos de PCR sin abrir el tubo. - detectores de PCR fluorescentes y termocicladores para PCR en tiempo real.

Los requisitos sanitarios y epidemiológicos para el tratamiento primario del esputo son similares a los requisitos microbiológicos estándar para el trabajo con micobacterias tuberculosis.

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Finalización del equipo de laboratorio para diagnóstico de PCR

El laboratorio incluye equipamiento para las siguientes salas.

  • sala para la preparación de muestras, contiene el siguiente equipo: laminar de la clase II de protección "SP-1.2": termostato de estado sólido con una cubierta de calentamiento para tubos de ensayo del tipo "Eppendorf"; microcentrífuga a 13,000 rpm; una centrífuga (Vortex); refrigerador con un rango de temperatura de -20 о С a +10 о С; pipetas de volumen variable de la serie "Rroline"; una bomba con un matraz trampa OM-1; un trípode para pipetas; estación de trabajo trípode 200x0.5 ml; estación de trabajo trípode 50x1.5 ml; Soportes para almacenar tubos de ensayo de 80x1.5 ml;
  • Sala de preparación de la mezcla de reacción: cámara de protección PCR-box ("Laminar-C. 110 cm); centrífuga - Vortex; Pipetas de volumen variable de la serie Proline; un trípode para pipetas; estación de trabajo trípode 200x0.2 ml; Soportes para almacenar tubos de ensayo de 80x1.5 ml; refrigerador con un rango de temperatura de -20 о С a + 10 о С;
  • espacio para electroforesis: cámara para electroforesis horizontal; fuente de alimentación; transiluminador;
  • Amplificadores de ADN o analizador de ácidos nucleicos (PCR en tiempo real) con una computadora y software; se puede colocar en cualquier habitación libre. Si se utiliza la tecnología de PCR en tiempo real. No se necesita espacio para la electroforesis.

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Control de calidad externo

Para tener confianza en la obtención de resultados objetivamente confiables, los laboratorios deben participar en el sistema de evaluación externa de la calidad de la investigación de laboratorio.

Los participantes en el sistema de control de calidad reciben; 12 viales de suspensiones de células bacterianas liofilizadas, dos de los cuales contienen la E. Coli E. Fibra de coco, 3 viales con Mycobacterium tuberculosis (cepa no virulenta) en 10 2 / ml; 3 ampollas con células de una cepa similar en una concentración de 10 4 / ml; 2 ampollas con micobacterias no tuberculosas M. Avium-intracellulare y M. Kansasii en una concentración de 10 5 / ml.

Las pruebas distribuidas para la evaluación externa de la calidad se prueban previamente en dos laboratorios independientes con amplia experiencia en este campo.

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