El papel de los depósitos de cristales en la patogénesis de la osteoartritis

Los cristales de fosfato cálcico básico (BCP) se encuentran en el líquido sinovial del 30-60% de los pacientes con osteoartritis. Según A. Swan et al. (1994), se encuentran cristales que contienen calcio en el líquido sinovial de un número mucho mayor de pacientes con osteoartritis; sin embargo, debido al tamaño extremadamente pequeño de los cristales o a su pequeño número, no se identifican utilizando técnicas convencionales. La presencia de cristales de BCP en el líquido sinovial se correlaciona con signos radiográficos de degeneración del cartílago articular y se asocia con un mayor volumen de derrame en comparación con el derrame en articulaciones de rodilla sin cristales. Un estudio de los factores que influyen en la progresión radiográfica de la gonartrosis mostró que la deposición de cristales de pirofosfato cálcico dihidratado (CPPD) es un predictor de un resultado clínico y radiográfico desfavorable. En un estudio con pacientes de edad avanzada, se observó una asociación entre la osteoartritis y la condrocalcinosis, especialmente en el compartimento tibiofemoral lateral de la rodilla y las tres primeras articulaciones metacarpofalángicas. Es frecuente encontrar ambos tipos de cristales, OFC y PFC, en pacientes con osteoartritis.

Clínicamente, la degeneración del cartílago articular causada por la deposición de cristales de calcio difiere de la observada en la osteoartrosis primaria. Si los cristales fueran un simple epifenómeno de la degeneración del cartílago, se encontrarían en las articulaciones más frecuentemente afectadas por la osteoartrosis primaria, es decir, las rodillas, las caderas y las pequeñas articulaciones de las manos. Por el contrario, las enfermedades por deposición de cristales afectan con mayor frecuencia a las articulaciones que no son típicas de la osteoartrosis primaria, como el hombro, la muñeca y el codo. La presencia de cristales en el líquido articular (derrame) se asocia con una degeneración más severa del cartílago articular. La cuestión de cuál es la causa y cuál es el efecto, la deposición de cristales o la degeneración del cartílago, es debatida. Una posición intermedia la ocupa la siguiente suposición: una anomalía primaria en el metabolismo del cartílago conduce a su degeneración, y la deposición secundaria de cristales acelera su degradación (la llamada teoría del bucle de amplificación).

El mecanismo exacto por el cual los cristales de calcio dañan el cartílago articular se desconoce y se resume a continuación. Teóricamente, los cristales de calcio pueden dañar directamente a los condrocitos. Sin embargo, el examen histológico rara vez revela cristales cerca de los condrocitos, y aún más raramente son ingeridos por ellos. El mecanismo más probable es la fagocitosis de los cristales por las células del revestimiento sinovial, seguida de la liberación de enzimas proteolíticas o la secreción de citocinas que estimulan la liberación de enzimas por los condrocitos. Este concepto está respaldado por un estudio del papel de la sinovitis inducida por PFKD en el desarrollo de osteoartritis de progresión rápida en la artropatía por pirofosfato. En este estudio, se inyectaron semanalmente cristales de pirofosfato de calcio dihidratado (1 o 10 mg) en la rodilla derecha de conejos con osteoartritis inducida por meniscectomía lateral parcial. Resultó que después de 8 inyecciones, la articulación de la rodilla derecha mostró cambios significativamente más graves en comparación con la izquierda. La intensidad de la inflamación sinovial se correlacionó con las inyecciones intraarticulares de cristales de pirofosfato de calcio dihidratado y su dosis. A pesar de que las dosis de cristales de CPPD utilizadas en este estudio superan las in vivo, los resultados indican el papel de la inflamación inducida por CPPD en la progresión de la osteoartritis en la artropatía por pirofosfato.

Los mecanismos potenciales de inducción de daño al cartílago articular por cristales que contienen calcio están asociados con sus propiedades mitogénicas, la capacidad de inducir MMP y estimular la síntesis de prostaglandinas.

Efecto mitogénico de los cristales que contienen calcio. En las artropatías asociadas a cristales, se observa con frecuencia la proliferación de las células del revestimiento sinovial, siendo los propios cristales solo parcialmente responsables de este proceso. El aumento en el número de células sinoviales se acompaña de una mayor secreción de citocinas, que promueven la condrólisis e inducen la secreción de enzimas proteolíticas. Los cristales de OFC en concentraciones encontradas en la patología articular humana estimulan de forma dosis-dependiente la mitogénesis de cultivos de fibroblastos cutáneos en reposo y fibroblastos sinoviales caninos y murinos. Los cristales de pirofosfato de calcio dihidratado, urato, sulfato, carbonato y fosfato de calcio estimulan el crecimiento celular. El inicio y el pico de la incorporación de ( ^3H )-timidina inducidos por estos cristales se desplazan 3 h en comparación con la estimulación de células con suero sanguíneo. Este período de tiempo puede ser necesario para la fagocitosis y la disolución de los cristales. La adición de cristales de control del mismo tamaño (p. ej., polvo de diamante o partículas de látex) no estimuló la mitogénesis. Los cristales de urato de sodio monohidratado presentaron propiedades mitogénicas débiles y fueron significativamente inferiores a las del urato de calcio, lo que indica la importancia del contenido de calcio de los cristales en la mitogénesis. Los cristales sintéticos de OFC presentaron las mismas propiedades mitogénicas que los cristales obtenidos de pacientes con condrocalcinosis. El efecto mitogénico de los cristales con calcio no se debió a un aumento del contenido de calcio del medio nutritivo circundante in vitro, ya que la disolución de los cristales de fosfato de calcio básico en el medio nutritivo no estimuló la incorporación de ( ^₃H )-timidina por los fibroblastos.

Un mecanismo propuesto para la mitogénesis inducida por OFC es que la proliferación anormal de células sinoviales puede deberse, al menos en parte, a la endocitosis y disolución intracelular de cristales, lo que aumenta las concentraciones citoplasmáticas de Ca ²⁺ y activa la vía dependiente de calcio que conduce a la mitogénesis. Este concepto está respaldado por el requisito de contacto directo célula-cristal para estimular la mitogénesis, ya que la exposición de cultivos celulares a cristales indujo el crecimiento celular, mientras que la exposición de células privadas de dicho contacto no lo hizo. Para estudiar el requisito de fagocitosis de cristales después de la interacción célula-cristal, se cultivaron células con ⁴⁵ Ca-OPC y ( ³ H)-timidina. Se encontró que las células que contenían ⁴⁵ Ca-OPC incorporaron significativamente más ( ³ H)-timidina que las células sin marcaje de fosfato de calcio básico. En cultivos de macrófagos, la inhibición de la endocitosis de cristales por citocalasina resultó en la inhibición de la disolución de los cristales, lo que resalta aún más la necesidad de fagocitosis.

Los cristales de calcio son solubles en ácido. Tras la fagocitosis, se disuelven en el ambiente ácido de los fagolisosomas de los macrófagos. La cloroquina, el cloruro de amonio, la bafilomicina A1 y todos los agentes lisosomotróficos que aumentan el pH lisosomal, de forma dosis-dependiente, inhiben la disolución intracelular de los cristales y la captación de (3H)-timidina ^en fibroblastos cultivados con cristales básicos de fosfato de calcio.

La adición de cristales de OFC a un cultivo de fibroblastos en monocapa provocó un aumento inmediato de diez veces en el calcio intracelular, que volvió a su valor basal después de 8 min. La fuente de calcio fue predominantemente ion extracelular, ya que los cristales de fosfato de calcio básico se añadieron a un medio de cultivo sin calcio. El siguiente aumento en la concentración de calcio intracelular se observó después de 60 min y se prolongó durante al menos 3 h. En este caso, la fuente de calcio fueron los cristales fagocitados disueltos en los fagolisosomas.

Se encontró que el efecto mitogénico de los cristales de OFC es similar al del PDGF como factor de crecimiento; al igual que este último, los cristales de OFC exhiben sinergia con IGF-1 y plasma sanguíneo. El bloqueo de IGF-1 reduce la mitogénesis celular en respuesta a OFC. PG Mitchell et al. (1989) demostraron que la inducción de la mitogénesis en fibroblastos Balb/c - ₃ T3 _por cristales de OFC requiere la presencia de serina/treonina proteína quinasa C (PKC), uno de los principales mediadores de las señales generadas durante la estimulación externa de células con hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento. Una disminución en la actividad de PKC en células Balb/c-3 T3 _{inhibe la inducción mediada porOFC} de los protooncogenes c-fos y c-myc, pero no afecta la estimulación de estos oncogenes mediada por PDGF.

El aumento del calcio intracelular tras la disolución de los cristales fagocitados no es la única vía de señalización para la mitogénesis. Cuando factores de crecimiento como el PDGF se unen a su receptor de membrana, se estimula la fosfolipasa C (una fosfodiesterasa), que hidroliza el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato para formar los mensajeros intracelulares inositol-3-fosfato y diacilglicerol. El primero libera calcio del retículo endoplasmático modulando la actividad de enzimas dependientes del calcio y de calcio/calmodulina, como las proteincinasas y las proteasas.

R. Rothenberg y H. Cheung (1988) informaron de un aumento en la degradación del fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato por la fosfolipasa C en células sinoviales de conejo en respuesta a la estimulación con cristales de OFC. Esta última incrementó significativamente el contenido de inositol-1-fosfato en células con ( ^₃H )-inositol marcado; el pico se alcanzó en 1 min y persistió durante aproximadamente 1 h.

El diacilglicerol es un activador potencial del pirofosfato de calcio dihidratado. Dado que los cristales de OFC aumentan la actividad de la fosfolipasa C, lo que conduce a la acumulación de diacilglicerol, en consecuencia, se puede esperar un aumento en la activación de PKC. PG Mitchell et al. (1989) compararon los efectos de los cristales de OFC y PDGF en la síntesis de ADN por _{fibroblastos Balb/c-3T3}. En cultivo celular, la PKC se inactivó mediante la incubación de células con diéster de forbol que soporta tumores (TPD), un análogo del diacilglicerol. La estimulación a largo plazo con dosis bajas de TPD disminuyó la actividad de PKC, mientras que una sola estimulación con una dosis alta la activó. La estimulación de la síntesis de ADN por cristales de OFC se suprimió después de la inactivación de PKC, lo que indica la importancia de esta enzima en la mitogénesis inducida por OFC. Previamente, GM McCarthy et al. (1987) demostraron una relación entre la respuesta mitogénica de fibroblastos humanos a los cristales de OFC y la activación de la PKC. Sin embargo, los cristales de OFC no activan la fosfatidilinositol 3-quinasa ni las tirosina quinasas, lo que confirma que el mecanismo de activación celular por cristales de OFC es selectivo.

La proliferación celular está controlada por un grupo de genes llamados protooncogenes. Las proteínas foe y mye, productos de los protooncogenes c-fos y c-myc, se localizan en el núcleo celular y se unen a secuencias específicas de ADN. La estimulación de fibroblastos 3T3 con cristales de OFC produce la expresión de c-fos en pocos minutos, alcanzando un máximo a los 30 minutos de la estimulación. La inducción de la transcripción de c-myc por cristales de OFC o PDGF ocurre en la primera hora y alcanza un máximo a las 3 horas de la estimulación. Las células mantienen un nivel elevado de transcripción de c-fos y c-myc durante al menos 5 horas. En células con PCD inactivado, la estimulación de c-fos y c-myc por cristales de OFC o TFD se suprime significativamente, mientras que la inducción de estos genes por PDGF no cambia.

Los miembros de la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP K) son reguladores clave de diversas cascadas de señalización intracelular. Una subclase de esta familia, p42/p44, regula la proliferación celular mediante un mecanismo que implica la activación de los protooncogenes c-fos y c-jun. Los cristales de OFC y PFKD activan una vía de señalización de las proteínas quinasas que involucra tanto a p42 como a p44, lo que sugiere un papel de esta vía en la mitogénesis inducida por cristales que contienen calcio.

Finalmente, la mitogénesis inducida por OFC involucra el factor de transcripción factor nuclear κB (NF-κB), descrito inicialmente como el gen de la cadena ligera κ de inmunoglobulina (IgK). Es un factor de transcripción inducible importante en numerosas vías de señalización, ya que regula la expresión de diversos genes. La inducción de NF-κB suele ir acompañada de la liberación de proteínas inhibidoras llamadas IκB desde el citoplasma. La inducción de NF-κB es seguida por la translocación del factor de transcripción activo al núcleo. Los cristales de OFC inducen NF-κB en fibroblastos Balb/c- _3T3 y fibroblastos de piel humana.

Varias vías pueden estar involucradas en la transducción de señales después de la activación de NF-κB, pero todas involucran a las proteína quinasas que fosforilan (y por lo tanto degradan) IκB. Con base en estudios in vitro, anteriormente se pensaba que IκB servía como sustrato para las quinasas (p. ej., PKC y proteína quinasa A). Sin embargo, recientemente se ha identificado un complejo de quinasa IκB de gran peso molecular. Estas quinasas fosforilan específicamente residuos de serina de IκB. La activación de NF-κB por TNF-α e IL-1 requiere la acción eficiente de la quinasa inductora de NF-κB (NIK) y la quinasa IκB. Actualmente se desconoce el mecanismo molecular de la activación de NIK. Aunque los cristales de OFC activan tanto PKC como NF-κB, se desconoce hasta qué punto estos dos procesos pueden estar relacionados. Dado que la modificación de la quinasa GκB se produce mediante fosforilación, no se puede descartar un papel de la PKC en la inducción de NF-κB por cristales de OFC mediante fosforilación y activación de la quinasa GκB. Esta idea se sustenta en la inhibición de la mitogénesis inducida por cristales de OFC y la expresión de NF-κB por estaurosporina, un inhibidor de la PKC. De igual forma, la estaurosporina puede inhibir la quinasa GκB y, por lo tanto, inhibe la proteína quinasa A y otras proteínas quinasas.

Por tanto, el mecanismo de mitogénesis inducida por cristales de OFC en fibroblastos incluye al menos dos procesos diferentes:

• un evento rápido unido a la membrana que resulta en la activación de PKC y MAP K, la inducción de NF-κB y protooncogenes,
• disolución intracelular más lenta de los cristales, lo que conduce a un aumento del contenido intracelular de Ca ²⁺ y, posteriormente, a la activación de una serie de procesos dependientes del calcio que estimulan la mitogénesis.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Inducción por cristales que contienen calcio y MMP

Los mediadores del daño tisular por los cristales que contienen calcio son las MMP: colagenasa-1, estromelisina, gelatinasa de 92 kD y colagenasa-3.

Dada la relación entre el contenido de cristales de OFC y la destrucción del tejido articular, se planteó la hipótesis de que los cristales de OFC, y posiblemente algunos colágenos, son fagocitados por las células sinoviales. Los sinovocitos estimulados proliferan y secretan proteasas. Esta hipótesis se comprobó in vitro añadiendo OFC natural o sintético, PFCD y otros cristales a sinovocitos humanos o caninos cultivados. La actividad de las proteasas y colagenasas neutras aumentó de forma dosis-dependiente y fue aproximadamente de 5 a 8 veces mayor que la del cultivo celular control cultivado sin cristales.

En células cultivadas en un medio que contenía cristales, se detectó coinducción de ARNm de colagenasa-1, estromelisina y gelatinasa-92 kDa, seguida de secreción de enzimas en el medio.

Los cristales de OFC también indujeron la acumulación de ARNm de colagenasa-1 y colagenasa-2 en condrocitos porcinos maduros, seguida de la secreción de las enzimas en el medio.

GM McCarty et al. (1998) estudiaron el papel de la disolución intracelular de cristales en la producción de MMP inducida por cristales. La elevación del pH lisosomal con bafilomicina A inhibió la disolución intracelular de cristales y también atenuó la respuesta proliferativa de fibroblastos humanos a los cristales de OFC, pero no inhibió la síntesis ni la secreción de MMP.

Ni los cristales de fosfato de calcio básico ni los de PFCD indujeron la producción de IL-1 in vitro, pero los cristales de urato de sodio sí lo hicieron.

Los datos actuales indican claramente una estimulación directa de la producción de MMP por fibroblastos y condrocitos al entrar en contacto con cristales que contienen calcio.

Los síntomas de la osteoartritis indican un papel importante de la MMP en la progresión de la enfermedad. La presencia de cristales de calcio aumenta la degeneración tisular de las articulaciones afectadas.

Estimulación de la síntesis de prostaglandinas

Además de estimular el crecimiento celular y la secreción de enzimas, los cristales de calcio provocan la liberación de prostaglandinas, especialmente PGE2, en cultivos celulares de mamíferos _. La liberación de PGE2 ocurre _en todos los casos durante la primera hora tras la exposición de las células a los cristales. R. Rothenberg (1987) determinó que las principales fuentes de ácido araquidónico para la síntesis de PGE2 _son la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina, y confirmó que la fosfolipasa A2 _y el NOX son las vías dominantes para _{la producción} de PGE2.

La PGE1 también puede liberarse en respuesta a los cristales de OFA. GM McCarty et al. (1993, 1994) estudiaron los efectos de la PGE2 _, la PGE2+ y su análogo, el misoprostol, en la respuesta mitogénica de fibroblastos humanos a los cristales de OFA. Los tres agentes inhibieron la respuesta mitogénica de forma dosis-dependiente, siendo la PGE2+ y el misoprostol los que mostraron una actividad inhibitoria más pronunciada. La PGE2+ y el misoprostol, pero no la PGE2+ _, inhibieron la acumulación de ARNm de la colagenasa en respuesta a los cristales de OFA.

MG McCarty y H. Cheung (1994) investigaron el mecanismo de activación celular mediada por OFC mediante PGE. Los autores demostraron que la PGE, un inductor más potente de AMPc intracelular que la PGE2 _, y la PGE2+, inhibe la mitogénesis y la producción de MMP inducidas por OFC mediante una vía de transducción de señales dependiente de AMPc. Es posible que el aumento en la producción de PGE inducido por los cristales de OFC debilite sus otros efectos biológicos (mitogénesis y producción de MMP) mediante un mecanismo de retroalimentación.

Inflamación inducida por cristales

Los cristales de calcio se encuentran a menudo en el líquido sinovial de pacientes con osteoartrosis; sin embargo, los episodios de inflamación aguda con leucocitosis son poco frecuentes tanto en la osteoartrosis como en las artropatías asociadas a cristales (por ejemplo, el síndrome del hombro de Milwaukee). El potencial flogístico de los cristales puede modificarse mediante diversos factores inhibidores. R. Terkeltaub et al. (1988) demostraron la capacidad del suero sanguíneo y el plasma para inhibir significativamente la respuesta de los granulocitos neutrófilos a los cristales de fosfato cálcico básico. Los factores que causan dicha inhibición son las proteínas de unión a los cristales. Un estudio de una de estas proteínas, la glicoproteína ₂ -HS (AHSr), demostró que la AHSr es el inhibidor más potente y específico de la respuesta de los granulocitos neutrófilos a los cristales de OFC. La AHSr es una proteína sérica de origen hepático; se sabe que, en comparación con otras proteínas séricas, se encuentra en concentraciones relativamente altas en el hueso y el tejido mineralizado. Además, el AHSr está presente en el líquido sinovial no inflamado y también se ha detectado en cristales de fosfato cálcico básico en el líquido sinovial nativo. Por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de que el AHSr module el potencial flogogénico de los cristales de fosfato cálcico básico in vivo.

Para resumir todo lo anterior, presentamos dos esquemas de patogénesis de la osteoartritis propuestos por WB van den Berg et al. (1999) y M. Carrabba et al. (1996), que combinan factores mecánicos, genéticos y bioquímicos.