Prueba NBT: evaluación del estallido oxidativo de los neutrófilos

La prueba espontánea de nitroazul de tetrazolio es un método citoquímico para evaluar el metabolismo oxidativo de los neutrófilos sin estimulación externa in vitro. Su principio se basa en que, tras la formación del anión superóxido, un colorante amarillo soluble se reduce a un formazán oscuro insoluble, que puede visualizarse en la célula al microscopio. En esencia, la prueba evalúa la capacidad del fagocito para iniciar la fase dependiente de oxígeno de la respuesta microbicida.

Biológicamente, esta prueba está vinculada a la función del complejo nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa del neutrófilo. Cuando el complejo funciona con normalidad, la célula produce especies reactivas de oxígeno y puede reducir el nitroazul de tetrazolio a formazán. Si el sistema se daña, el número de células teñidas disminuye o desaparece. Por ello, la prueba NBT ha desempeñado históricamente un papel importante en el diagnóstico de la enfermedad granulomatosa crónica. [1]

Es importante diferenciar ambos métodos. La prueba espontánea evalúa la actividad basal de los neutrófilos sin la adición de un estimulador estándar. La prueba activada, o estimulada, se realiza tras la exposición a una sustancia que desencadena un estallido oxidativo, como el acetato de miristato de forbol u otro estímulo. Clínicamente, no son lo mismo: la prueba espontánea es más sensible a la activación actual de los neutrófilos, mientras que la prueba estimulada es más sensible a la reserva del sistema. [2]

Históricamente, los laboratorios se han basado en valores bajos e inequívocos de neutrófilos positivos para formazán en individuos sanos para las pruebas espontáneas. Sin embargo, el problema actual radica en que los métodos de prueba de NBT han evolucionado durante mucho tiempo sin una estandarización completa, por lo que no existe un intervalo de referencia moderno universal e igualmente validado para diferentes laboratorios. Esta es una de las razones por las que la interpretación de las pruebas siempre ha sido difícil. [3]

Desde un punto de vista práctico, la prueba de NBT espontánea no indica "inmunidad general" ni "presencia de infección". Refleja únicamente un aspecto específico de la respuesta inmunitaria innata: la capacidad de un neutrófilo para generar especies reactivas de oxígeno en las condiciones de un sistema de prueba determinado. Por lo tanto, nunca debe utilizarse como único criterio diagnóstico. [4]

Tabla 1. ¿Qué evalúa exactamente la prueba NST?

Parámetro	Prueba NST espontánea	Prueba activada con NST
¿Qué se está comprobando?	Actividad oxidativa basal de los neutrófilos	Reserva de explosión oxidativa después de la estimulación
Significado biológico	Preparación previa de la célula para formar especies reactivas de oxígeno	La capacidad de aumentar drásticamente el estallido respiratorio.
El papel histórico principal	Ensayo de activación de neutrófilos, un antiguo marcador infeccioso e inmunológico	Detección de defectos del sistema oxidasa, especialmente en la enfermedad granulomatosa crónica
Método de lectura	Microscopía de células positivas a formazán	Microscopía o evaluación semicuantitativa después de la estimulación
El principal problema moderno	Muy baja especificidad	Inferior a la citometría de flujo con dihidrorodamina

La tabla resume las diferencias entre los enfoques NST espontáneos y estimulados. [5]

La importancia histórica de la prueba y lo que ha cambiado en la práctica moderna

La prueba NBT fue un método clave para estudiar la función de los neutrófilos en las décadas de 1960 y 1970. Permitió la identificación clínica de defectos de estallido oxidativo en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica. Esto representó un avance significativo en su momento, ya que la prueba permitió la detección de defectos bactericidas fagocíticos incluso antes de la llegada de las tecnologías modernas de flujo continuo. [6]

Con el tiempo, se hizo evidente que la versión espontánea del método dependía demasiado de factores externos e internos. En revisiones anteriores se indicaba explícitamente que tanto las pruebas de NST espontáneas como las estimuladas presentaban numerosas modificaciones de protocolo, falta de una estandarización estricta y una reproducibilidad limitada. Esto no invalidó la prueba, pero limitó considerablemente su fiabilidad como herramienta diagnóstica general. [7]

En inmunología y hematología clínica modernas, la prueba NBT ha sido sustituida en la mayoría de los centros por la prueba de citometría de flujo con dihidrorodamina. GeneReviews señala que la prueba de dihidrorodamina es superior a otras pruebas en la enfermedad granulomatosa crónica, y una revisión de 2024 la considera el estándar de oro actual para evaluar la función de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa. [8]

Las razones de este cambio son claras. El ensayo de dihidrorodamina es cuantitativo, más sensible, más fácil de estandarizar y evalúa la señal en cada célula individual. Detecta mejor la actividad residual de la oxidasa, reconoce mejor las poblaciones en mosaico en portadores de la forma ligada al cromosoma X y es más adecuado para el seguimiento tras el trasplante y en variantes genéticas más complejas de la enfermedad. [9]

Sin embargo, la prueba NST no ha desaparecido por completo. Una revisión de 2024 destaca que aún puede ser útil en entornos con recursos limitados donde no se dispone de citometría de flujo, se necesitan resultados rápidamente y existe experiencia local en la realización de la prueba. Esto no la equipara con el estándar actual, pero explica por qué el método se sigue utilizando en algunos laboratorios. [10]

Tabla 2. Prueba NST histórica y prueba moderna de dihidrorodamina

Característica	Prueba NST	Prueba de dihidrorodamina
Tecnología	Citoquímico, microscópico	Citometría de flujo
Tipo de evaluación	Principalmente cualitativos o semicuantitativos	Cuantitativo
Sensibilidad parcial a defectos	Abajo	Más alto
Evaluación de portadores de la forma ligada al cromosoma X	Limitado	Mucho mejor
Evaluación de la función de la oxidasa residual	Limitado	Bien
Estado actual	Método histórico y auxiliar	El método moderno preferido

Tabla basada en GeneReviews y la revisión de 2024 sobre el diagnóstico de la enfermedad granulomatosa crónica.[11]

Por qué la prueba NST espontánea no puede utilizarse como marcador universal de infección

En la literatura clínica más antigua, la prueba de NBT espontánea se estudió activamente como una posible forma de diferenciar la infección bacteriana de las afecciones no bacterianas. La lógica era clara: los neutrófilos activados por la infección bacteriana deberían restaurar el colorante con mayor frecuencia y producir más células positivas al formazán. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que esta idea es demasiado inestable. [12]

Una revisión de 1975, aún considerada un resumen importante del método, declaró explícitamente que la prueba NST no puede considerarse un método absoluto para distinguir entre infecciones bacterianas y no bacterianas o enfermedades no infecciosas, ya que los resultados falsos positivos y falsos negativos eran frecuentes. En otras palabras, ni siquiera los datos acumulados históricamente confirmaron la especificidad esperada para la variante espontánea. [13]

El trabajo en dermatología también fue muy revelador: en pacientes con dermatosis inflamatorias infecciosas y no infecciosas, la NST espontánea a menudo estaba elevada, pero era deficiente para distinguir entre procesos cutáneos bacterianos y virales. Además, la prueba también aumentó en diversas enfermedades inflamatorias no infecciosas, lo que demuestra aún más su inespecificidad. [14]

Esto se explica biológicamente. La prueba espontánea responde no solo al microbio, sino también al nivel general de activación de neutrófilos. Este aumento es posible en afecciones alérgicas, autoinmunes, inflamatorias y otras donde se estimula la inmunidad innata sin infección bacteriana directa. Por lo tanto, interpretar un NST espontáneo alto como un "signo de bacterias" es demasiado burdo y clínicamente peligroso. [15]

En la práctica moderna, ni la sepsis, ni la neumonía bacteriana, ni la fiebre de origen desconocido se diagnostican con base en la prueba NST espontánea. Esta prueba no se incluye en los algoritmos rutinarios actuales para el diagnóstico de infecciones, y su uso histórico en esta función se considera ahora mejor como una etapa en el desarrollo de la inmunología de laboratorio que como un estándar actual. [16]

Tabla 3. Por qué un NST espontáneo alto o bajo no equivale a un diagnóstico

Resultado	¿Qué podría significar esto?	¿Por qué esto no es suficiente?
Promoción	Activación de los neutrófilos durante una infección o inflamación	Un aumento es posible incluso sin una infección bacteriana.
Resultado normal	Falta de activación basal pronunciada	No excluye infección ni defecto de fagocitos.
Disminuir	Disfunción grave de neutrófilos, inmunodeficiencia o influencias de laboratorio.	Se necesitan pruebas funcionales confirmatorias
Muy bajo si se sospecha enfermedad granulomatosa crónica	Posible defecto en el sistema oxidasa	Se necesita una prueba confirmatoria moderna
Alto en alergias o inflamación autoinmune	Activación inespecífica de la inmunidad innata	No dice nada sobre la naturaleza del proceso.

La tabla refleja la principal limitación de la prueba NST espontánea: la no especificidad. [17]

Donde la prueba realmente importa: enfermedad granulomatosa crónica y defectos de estallido oxidativo

La principal aplicación clásica de la prueba NBT es la enfermedad granulomatosa crónica, un trastorno congénito de la función fagocítica en el que los neutrófilos son incapaces de generar superóxido y otras especies reactivas de oxígeno con normalidad. Estos pacientes presentan infecciones bacterianas y fúngicas graves y recurrentes, granulomas y complicaciones inflamatorias. [18]

GeneReviews destaca que, bajo estimulación normal en individuos sanos, más del 95 % de los neutrófilos reducen el nitroazul de tetrazolio a formazán, mientras que en la enfermedad granulomatosa crónica, las células con esta reacción están ausentes o su número se reduce drásticamente. Este fenómeno ha convertido a la prueba NBT en un método diagnóstico histórico reconocido para la enfermedad. [19]

Sin embargo, es importante hacer una aclaración muy precisa: en el caso de la enfermedad granulomatosa crónica, la prueba estimulada, no la puramente espontánea, es la clínicamente significativa. La prueba de NBT espontánea evalúa la activación basal y, por sí sola, no es la herramienta óptima para demostrar un defecto innato del estallido oxidativo. Para este propósito, la prueba de NBT estimulada y, aún mejor, la prueba de dihidrorodamina son mucho más informativas. [20]

Revisiones recientes enfatizan específicamente que la prueba NST es menos efectiva para detectar formas parciales de enfermedad granulomatosa crónica, actividad sistémica residual y poblaciones celulares mixtas en portadores de la forma ligada al cromosoma X. Es en estos escenarios clínicamente desafiantes que la prueba de dihidrorodamina tiene una clara ventaja. [21]

Hay otro matiz importante. En la deficiencia grave de mieloperoxidasa, la prueba de dihidrorodamina puede producir una falsa apariencia de enfermedad granulomatosa crónica, mientras que la prueba de NST en estos pacientes permanece normal. Por lo tanto, en casos complejos, la prueba de NST, más antigua, a veces conserva un valor diferencial adicional, pero esta es una tarea altamente especializada, en lugar de un uso generalizado de la variante espontánea. [22]

Tabla 4. Cuándo pensar en la enfermedad granulomatosa crónica

Situación clínica	¿Por qué es esto alarmante?
Abscesos profundos recurrentes	Característica de un defecto en la muerte fagocítica de microbios.
Infecciones fúngicas invasivas, especialmente Aspergillus	Típico de la enfermedad granulomatosa crónica
Neumonía, linfadenitis, osteomielitis, abscesos hepáticos y cutáneos.	Espectro infeccioso clásico
Granulomas del tracto gastrointestinal o genitourinario	Manifestación inflamatoria frecuente
Antecedentes familiares de infecciones similares	Apoya la naturaleza hereditaria
Prueba sospechosa de NST o dihidrorodamina	Requiere confirmación inmunológica y genética.

Tabla basada en GeneReviews, ESID y revisión de 2024.[23]

Cómo examinar adecuadamente a un paciente hoy si la antigua prueba NST es anormal

Si una prueba de NBT espontánea o estimulada resulta anormal, el enfoque moderno correcto no consiste en repetirla indefinidamente, sino en avanzar a un nivel funcional de diagnóstico más preciso. En la mayoría de los centros, este nivel se considera la prueba de citometría de flujo con dihidrorodamina. ARUP recomienda explícitamente esta prueba como prueba de cribado para la enfermedad granulomatosa crónica. [24]

El siguiente paso tras confirmar el defecto de estallido oxidativo es esclarecer su naturaleza. Una revisión de 2024 indica que, tras la confirmación funcional de la ausencia o disminución de la actividad de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa, se puede examinar la expresión de proteínas individuales del complejo y realizar diagnósticos moleculares para determinar la causa genética específica. [25]

Si el resultado de la prueba de dihidrorodamina sugiere enfermedad granulomatosa crónica, pero el cuadro clínico es inusual, se deben considerar diagnósticos diferenciales. El más importante es la deficiencia de mieloperoxidasa, que puede producir un resultado atípico en la prueba de dihidrorodamina, así como ciertas formas graves de deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y, en raras ocasiones, disfunción neutrófila adquirida. [26]

Las pruebas de este nivel deben realizarse con neutrófilos vivos y bajo estrictas condiciones preanalíticas. ARUP enfatiza que la prueba de dihidrorodamina requiere sangre completa fresca, temperatura ambiente para el transporte y no requiere refrigeración ni congelación, ya que la prueba depende de la función intacta de las células vivas. [27]

Por lo tanto, una prueba de NST patológica hoy en día no es una respuesta definitiva, sino más bien una razón para avanzar rápidamente hacia diagnósticos funcionales y genéticos más fiables. Esta es una diferencia crucial entre el artículo moderno y la antigua lógica de laboratorio, donde la prueba de NST en sí misma se percibía a veces como un diagnóstico casi definitivo. [28]

Tabla 5. Algoritmo moderno después de una prueba NST patológica

Escenario	Qué hacer
1	Evaluar el contexto clínico: infecciones, granulomas, antecedentes familiares.
2	Realizar una prueba de dihidrorodamina mediante citometría de flujo.
3	Si se confirma el defecto, estudiar las proteínas del complejo nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa y la genética.
4	Eliminar imitadores, especialmente la deficiencia de mieloperoxidasa.
5	Remitir al paciente a un inmunólogo clínico o hematólogo con experiencia en el tratamiento de defectos congénitos de los fagocitos.

Tabla basada en GeneReviews, ARUP y revisión de 2024.[29]

Limitaciones de la prueba NST espontánea y por qué ha caído en desuso en la práctica habitual

La principal limitación metodológica de la prueba NST es su escasa estandarización. Incluso una revisión clásica de 1975 destacó las numerosas modificaciones del método, lo que genera una variabilidad significativa en los resultados entre laboratorios. Para el clínico moderno, esto significa algo simple: el mismo porcentaje de células positivas al formazán puede interpretarse de forma diferente según el protocolo. [30]

La segunda limitación es su naturaleza semicuantitativa. La prueba NBT se lee microscópicamente y se basa esencialmente en la evaluación manual del número de células teñidas y la intensidad de la reacción. En comparación con la citometría de flujo, es menos precisa, menos reproducible y menos adecuada para detectar defectos débiles, parciales y en mosaico. [31]

La tercera limitación es la baja especificidad de la variante espontánea. Esta puede estar elevada en diversas afecciones inflamatorias y no infecciosas y disminuida en diversos escenarios de inmunosupresión secundaria. Por lo tanto, la NST espontánea no proporciona una respuesta fiable ni a la pregunta "¿existe una infección bacteriana?" ni a la pregunta "¿existe una inmunodeficiencia primaria?" cuando se utiliza sola. [32]

La cuarta limitación es la dificultad para identificar portadores y formas parciales de la enfermedad. GeneReviews afirma explícitamente que la NST puede malinterpretarse como normal en mujeres portadoras de la forma ligada al cromosoma X de la enfermedad granulomatosa crónica y en pacientes con variantes hipomórficas, donde la función residual de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa está parcialmente preservada. [33]

Son precisamente estos factores los que han llevado a que la prueba de NBT espontánea se considere hoy principalmente como una herramienta históricamente importante, pero limitada. Puede utilizarse en laboratorios aislados y entornos con recursos limitados, pero como estándar de rutina moderno para evaluar el estallido oxidativo de los neutrófilos, ha dado paso a métodos más precisos. [34]

Tabla 6. Principales limitaciones de la prueba NST espontánea

Limitación	¿Por qué es esto importante?
Mala estandarización	Es difícil comparar resultados entre laboratorios
Evaluación manual semicuantitativa	Menor precisión y reproducibilidad
Baja especificidad	Los aumentos y disminuciones ocurren en condiciones muy diferentes.
Baja sensibilidad a defectos parciales	Las formas leves de la enfermedad pueden pasar desapercibidas
Evaluación limitada del mosaicismo en portadores	El método es peor para los portadores ligados al cromosoma X
Desplazamiento por tecnologías más precisas	En la mayoría de los centros se prefiere la prueba de dihidrorodamina.

En la tabla se resumen las razones por las cuales la prueba tiene una importancia fundamentalmente histórica y auxiliar. [35]

Conclusión

La prueba espontánea de nitroazul de tetrazolio es un método histórico importante para evaluar el metabolismo oxidativo de los neutrófilos, que contribuyó a la comprensión moderna de la enfermedad granulomatosa crónica y otras disfunciones fagocíticas. Sin embargo, su utilidad clínica actual es significativamente menor que la que se indicaba en los manuales de laboratorio antiguos. [36]

La formulación moderna más precisa es la siguiente: la prueba de NBT espontánea no es una prueba independiente y fiable ni para el diagnóstico de infección bacteriana ni para la confirmación definitiva de un defecto congénito del estallido oxidativo. En la práctica moderna, sus resultados deben considerarse solo como auxiliares, y si se sospecha enfermedad granulomatosa crónica, se debe dar preferencia a la citometría de flujo con dihidrorodamina y al diagnóstico molecular posterior. [37]

Preguntas frecuentes

¿Qué es la prueba NBT espontánea en términos simples?
Es una antigua prueba de laboratorio que mide si los neutrófilos son capaces de reducir el nitroazul de tetrazolio a formazán oscuro sin estimulación externa. En esencia, refleja la actividad básica del mecanismo bactericida dependiente del oxígeno del fagocito.

¿En qué se diferencia una prueba espontánea de una activada?
La variante espontánea evalúa la actividad de fondo, mientras que la activada evalúa la reserva tras la estimulación artificial de la célula. Para el diagnóstico de defectos congénitos de estallido oxidativo, los métodos estimulados son clínicamente más importantes, y en la práctica moderna, la prueba de dihidrorodamina es aún más importante. [38]

¿Puede una prueba de NST espontánea diagnosticar una infección bacteriana?
No. Estudios clínicos históricos han demostrado que la prueba es demasiado inespecífica y produce muchos resultados falsos positivos y falsos negativos. No puede utilizarse como criterio independiente para la infección bacteriana. [39]

¿Un NST espontáneo elevado siempre indica una infección?
No. También es posible que haya elevaciones en afecciones inflamatorias no infecciosas, procesos alérgicos y autoinmunes, y con activación general de neutrófilos. Por lo tanto, un resultado alto por sí solo no determina la causa. [40]

¿Un NST espontáneo bajo siempre indica enfermedad granulomatosa crónica?
No. También puede presentarse en estados de inmunodeficiencia secundaria, estrés severo, mielosupresión y otras situaciones. Se necesita un algoritmo más preciso y moderno para confirmar la enfermedad granulomatosa crónica.

¿Qué prueba se considera actualmente la mejor para diagnosticar la enfermedad granulomatosa crónica?
La citometría de flujo con dihidrorodamina se considera la más preferida. Es más sensible, cuantitativa y mejor para detectar formas parciales de la enfermedad y portadores de la variante ligada al cromosoma X. [41]

¿Existen situaciones en las que la antigua prueba NST sigue siendo útil?
Sí. Puede utilizarse en entornos con recursos limitados donde no se dispone de citometría de flujo, y como método complementario en ciertas situaciones diferenciales complejas. Sin embargo, ya no es el estándar moderno para el diagnóstico de masas. [42]

¿Por qué la prueba de dihidrorodamina a veces produce resultados falsos positivos en la deficiencia de mieloperoxidasa?
Porque la reacción de la dihidrorodamina depende del sistema de peroxidasa celular. En la deficiencia grave de mieloperoxidasa, el resultado puede simular una enfermedad granulomatosa crónica, aunque el NST permanece normal. [43]

¿Es necesario realizar pruebas genéticas tras una prueba funcional patológica?
Sí, si se confirma un defecto de estallido oxidativo. Tras la prueba funcional, suele realizarse la confirmación molecular de la causa específica de la enfermedad y la aclaración del patrón hereditario. [44]