Métodos de genética molecular para el diagnóstico de enfermedades hereditarias

Los métodos de tecnología del ADN se utilizan para determinar la localización de un gen mutante en un cromosoma específico, responsable del origen de ciertas patologías hereditarias. Dado que un gen es una sección del ADN y una mutación genética es un daño a la estructura primaria del ADN (se entiende por mutación cualquier cambio en la secuencia del ADN, independientemente de su localización e impacto en la viabilidad de un individuo), mediante el análisis de preparaciones de cromosomas en metafase de un paciente con una enfermedad hereditaria, es posible determinar la localización del gen patológico. Los métodos de genética molecular brindan la oportunidad de diagnosticar enfermedades a nivel de alteración de la estructura del ADN y permiten determinar la localización de trastornos hereditarios. Los métodos de genética molecular pueden identificar mutaciones asociadas con la sustitución de incluso una sola base.

La etapa más importante de la identificación génica es su aislamiento. El ADN puede aislarse de cualquier tipo de tejido y célula con núcleo. Las etapas del aislamiento del ADN incluyen: lisis rápida de células, eliminación de fragmentos de orgánulos celulares y membranas mediante centrifugación, destrucción enzimática de proteínas y su extracción de la solución con fenol y cloroformo, y concentración de moléculas de ADN mediante precipitación en etanol.

En los laboratorios de genética, el ADN se aísla con mayor frecuencia de los leucocitos sanguíneos. Para ello, se extraen de 5 a 20 ml de sangre venosa del paciente y se introducen en un tubo de ensayo estéril con una solución anticoagulante (heparina). A continuación, los leucocitos se separan y procesan según los pasos descritos.

La siguiente etapa de la preparación del material para la investigación consiste en fragmentar el ADN en zonas con una secuencia de bases estrictamente específica. Esto se lleva a cabo mediante enzimas bacterianas: endonucleasas de restricción. Estas enzimas reconocen secuencias específicas de 4 a 6 nucleótidos, o con menos frecuencia, de 8 a 12, en una molécula de ADN bicatenario y la fragmentan en los puntos donde se encuentran estas secuencias, denominados sitios de restricción. El número de fragmentos de restricción resultantes se determina por la frecuencia de aparición de los sitios de restricción, y el tamaño de los fragmentos se determina por la distribución de estos sitios a lo largo de la molécula de ADN original. Cuanto mayor sea la frecuencia de los sitios de restricción, más cortos serán los fragmentos de ADN tras la restricción. Actualmente, se conocen más de 500 tipos diferentes de enzimas de restricción de origen bacteriano, y cada una de ellas reconoce su propia secuencia de nucleótidos. En el futuro, los sitios de restricción podrán utilizarse como marcadores genéticos del ADN. Los fragmentos de ADN formados como resultado de la restricción pueden ordenarse por longitud mediante electroforesis en un gel de agarosa o poliacrilamida, y así determinarse su peso molecular. Normalmente, el ADN en un gel se identifica mediante una tinción específica (generalmente con bromuro de etidio) y la observación del gel con luz ultravioleta transmitida. Los sitios de localización del ADN se colorean en rojo. Sin embargo, en humanos, cuando el ADN es procesado por varias enzimas de restricción, se forman tantos fragmentos de diferentes longitudes que no pueden separarse por electroforesis, es decir, no es posible identificar visualmente fragmentos de ADN individuales en la electroforesis (se obtiene una tinción uniforme a lo largo de todo el gel). Por lo tanto, para identificar los fragmentos de ADN deseados en dicho gel, se utiliza el método de hibridación con sondas de ADN marcadas.

Cualquier segmento monocatenario de ADN o ARN es capaz de unirse (hibridar) con una cadena complementaria, con la guanina siempre uniéndose a la citosina y la adenina a la timina. Así es como se forma una molécula bicatenaria. Si una copia monocatenaria de un gen clonado se marca con un marcador radiactivo, se obtiene una sonda. La sonda es capaz de encontrar un segmento complementario de ADN, que luego se identifica fácilmente mediante autorradiografía. Una sonda radiactiva añadida a una preparación de cromosomas estirados permite localizar el gen en un cromosoma específico: utilizando una sonda de ADN, se pueden identificar áreas específicas durante el Southern blotting. La hibridación ocurre si la sección de ADN que se está probando contiene un gen normal. En el caso de que haya una secuencia de nucleótidos anormal, es decir, las estructuras cromosómicas correspondientes contengan un gen mutante, no se producirá la hibridación, lo que permite determinar la localización del gen patológico.

Para obtener sondas de ADN, se utiliza el método de clonación génica. Este método consiste en insertar un fragmento de ADN correspondiente a un gen o a una sección de un gen en una partícula de clonación, generalmente un plásmido bacteriano (ADN extracromosómico anular presente en células bacterianas y portador de genes de resistencia a antibióticos). Posteriormente, las bacterias con el plásmido que contiene el gen humano insertado se multiplican. Gracias a los procesos de síntesis del plásmido, se pueden obtener miles de millones de copias del gen humano o de su sección.

Las copias de ADN resultantes, marcadas con una etiqueta radiactiva o fluorocromos, se utilizan luego como sondas para buscar secuencias complementarias entre el conjunto de moléculas de ADN estudiado.

Actualmente, existen muchos tipos diferentes de métodos que utilizan sondas de ADN para diagnosticar mutaciones genéticas.

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