Estudios inmunológicos en urología

La prescripción de un inmunograma a un paciente urológico implica que el médico tratante sospecha la presencia de trastornos en el sistema inmunitario. Las infecciones bacterianas, víricas y fúngicas recurrentes, las manifestaciones alérgicas y las enfermedades sistémicas pueden ser signos de estos trastornos, que se caracterizan por diversos síndromes (infecciosos, oncológicos, alérgicos, autoinmunes y linfoproliferativos). Un paciente puede presentar varios síndromes. Por ejemplo, las enfermedades infecciosas crónicas (síndrome infeccioso) pueden causar inmunodeficiencia, y esta puede manifestarse como una predisposición a enfermedades infecciosas y oncológicas (síndrome oncológico). La predisposición a las infecciones puede presentarse en el contexto de una inmunodeficiencia secundaria, desarrollada como resultado de una enfermedad linfoproliferativa, como la leucemia. Existen tres grupos principales de cambios patológicos en el sistema inmunitario:

• deficiencia cuantitativa o funcional de uno u otro eslabón del sistema inmune, que conduce al desarrollo de un estado de inmunodeficiencia;
• un trastorno en el reconocimiento de antígenos por el sistema inmune, que conduce al desarrollo de procesos autoinmunes;
• una respuesta inmune hiperreactiva o "pervertida", que se manifiesta por el desarrollo de enfermedades alérgicas.

Existen métodos de inmunodiagnóstico de cribado (pruebas de nivel 1) y de esclarecimiento (pruebas de nivel 2). Los primeros sirven para registrar alteraciones del sistema inmunitario, mientras que los segundos, para establecer los mecanismos implicados en su implementación con el fin de lograr una mayor inmunocorrección.

Inmunidad de células B

Métodos de detección

• Determinación del número relativo y absoluto de linfocitos B mediante inmunofluorescencia o citofluorometría de flujo con anticuerpos monoclonales contra antígenos de linfocitos B (CD19, CD20, donde CD significa clústeres de diferenciación). El contenido normal de linfocitos B en adultos es del 8 al 19 % del total de leucocitos o de 190 a 380 células/μl. Se observa un aumento del contenido de linfocitos B en infecciones bacterianas y fúngicas agudas y crónicas, hepatopatías crónicas, enfermedades sistémicas del tejido conectivo, leucemia linfocítica crónica y mieloma.
• Determinación de la concentración de inmunoglobulinas no específicas (F, M, G, E) mediante inmunodifusión radial simple, nefelometría o turbometría, radioinmunoensayo o enzimoinmunoensayo (ELISA). Valores normales para adultos: inmunoglobulina (Ig) A: 0,9-4,5 g/l; IgM: 0,3-3,7 g/l; IgG: 8,0-17 g/l. La concentración de inmunoglobulinas aumenta en las mismas condiciones patológicas en las que aumenta el número de linfocitos B. La concentración de inmunoglobulinas disminuye en casos de hipogammaglobulinemia congénita, neoplasias del sistema inmunitario, esplenomegalia, pérdida de proteínas, enfermedades renales o intestinales, y tratamiento con citostáticos e inmunosupresores.

Métodos de clarificación

• Determinación de inmunocomplejos circulantes en sangre mediante precipitación selectiva en polietilenglicol, seguida de una prueba de densidad espectrofotométrica (valor normal: 80-20 U). Un aumento de inmunocomplejos circulantes es típico en infecciones bacterianas, fúngicas y víricas agudas, enfermedades autoinmunes, enfermedades inmunocomplejas, enfermedad del suero y reacciones alérgicas de tipo 3.
• Determinación de inmunoglobulinas específicas en sangre en relación con antígenos bacterianos y virales, ácido desoxirribonucleico (ADN) en enfermedades autoinmunes, detección de anticuerpos antiespermáticos (infertilidad autoinmune) y antirrenales (pielonefritis y glomerulonefritis) por el método de inmunodifusión radial o ELISA.
• Determinación de anticuerpos antiespermáticos en espermatozoides [prueba MAR (reacción mixta de antiglobulina)], resultado normal-negativo.
• Determinación de la concentración de inmunoglobulinas en orina con fines de diagnóstico diferencial entre pielonefritis y glomerulonefritis (selectividad de proteinuria).
• Determinación del contenido de IgE en jugo prostático con el fin de diagnosticar prostatitis alérgica mediante el método de inmunodifusión radial o ELISA.
• Estudio de la respuesta en la reacción de transformación blástica de linfocitos B al mitógeno de células B (mitógeno de pokeweed para la estimulación de la reacción de transformación blástica de linfocitos B en presencia de linfocitos T), cuyo valor normativo es del 95-100%.

Vínculo de las células T con la inmunidad

Métodos de detección

• Determinación del número relativo y absoluto de linfocitos T CD3 maduros mediante inmunofluorescencia o citofluorometría de flujo con anticuerpos monoclonales anti-CD3. La norma en adultos es del 58-76 % o 1100-1700 células/μl. Una disminución del número de linfocitos T indica una insuficiencia del sistema inmunitario celular. Esto es típico de algunas inmunodeficiencias primarias y secundarias (infecciones bacterianas y víricas crónicas: tuberculosis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, tumores malignos, insuficiencia renal crónica, traumatismos, estrés, envejecimiento, desnutrición, tratamiento con citostáticos, exposición a radiaciones ionizantes). Un aumento del número de linfocitos T se produce en el contexto de hiperactividad inmunitaria o en enfermedades linfoproliferativas. En la inflamación, el número de linfocitos T primero aumenta y luego disminuye. La ausencia de disminución de linfocitos T indica un proceso inflamatorio crónico.
• Evaluación de subpoblaciones de linfocitos.
  • Determinación del número de células T cooperadoras (anticuerpos anti-CD4). Normalmente, entre el 36 % y el 55 % o entre 400 y 1100 células/mcl. El número de estas células aumenta en enfermedades autoinmunes, como la enfermedad de Waldenström y la activación de la inmunidad antitrasplante; el número de células T cooperadoras disminuye en infecciones crónicas bacterianas, víricas y protozoarias, tuberculosis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, tumores malignos, quemaduras, lesiones, desnutrición, envejecimiento, tratamiento con citostáticos y exposición a radiaciones ionizantes.
  • Determinación del número de supresores de células T (anticuerpos anti-CD4). Normalmente, entre el 17 % y el 37 % o entre 300 y 700 células/μl. El número de supresores de células T se incrementa en las mismas condiciones en que disminuye el número de células T cooperadoras, y su disminución se produce en las mismas condiciones en que aumenta el contenido de células T cooperadoras.
  • Índice inmunorregulador CD4/CD8: normalmente de 1,5 a 2,5. Hiperactividad con valores superiores a 2,5 (enfermedades alérgicas y autoinmunes); hipoactividad con valores inferiores a 1,0 (predisposición a infecciones crónicas). Al inicio del proceso inflamatorio, el índice inmunorregulador aumenta y, al disminuir, se normaliza.

Métodos de clarificación

• Determinación del número de células asesinas naturales (células NK): anticuerpos anti-CD16 y anti-CD56. La norma para los linfocitos CD16 es del 6-26%, y para los CD56, del 9-19%. El número de células NK aumenta durante el rechazo de trasplantes y disminuye en infecciones virales, cáncer, inmunodeficiencias primarias y secundarias, quemaduras, lesiones y estrés, tratamiento con citostáticos y exposición a radiaciones ionizantes.
• Determinación del número de linfocitos T con receptor para la interleucina-2 (marcador de activación): anticuerpos anti-CD25. La norma es del 10 al 15 %. Se observa un aumento en su número en enfermedades alérgicas, rechazo de trasplantes y respuesta a antígenos dependientes del timo en el período agudo de la primoinfección, y una disminución en las mismas enfermedades en las que se observa una disminución del número de células NK.
• Estudio de la expresión del marcador de activación, la molécula de histocompatibilidad de clase II HLA-DR. Su expresión aumenta en procesos inflamatorios, en pacientes con hepatitis C, enfermedad celíaca, sífilis y enfermedades respiratorias agudas.
• Evaluación de la apoptosis linfocitaria. Una idea aproximada de la preparación de los linfocitos para la apoptosis puede determinarse por la expresión del receptor Fas (CD95) en su superficie y el protooncogén bd-2 en la mitocondria. La apoptosis linfocitaria se evalúa tratándolos con dos tintes fluorescentes: yoduro de propidio, que se une a fragmentos de ADN, y anexina Y, que se une a la fosfatidilserina, que aparece en la membrana celular al inicio de la apoptosis. Los resultados se evalúan utilizando un citofluorómetro de flujo. Los resultados se calculan con base en la proporción de células teñidas con diferentes tintes. Las células no teñidas son viables, las células unidas solo a anexina Y son manifestaciones tempranas de apoptosis, con yoduro de propidio y anexina Y son manifestaciones tardías de apoptosis, la tinción con yoduro de propidio solo indica necrosis.
• Evaluación de la proliferación de linfocitos T in vitro.
  • Cambios en la blastogénesis celular: reacción de transformación de blastos linfocitarios. Los leucocitos se incuban con cualquier mitógeno de origen vegetal (lectinas). La fitohemaglutinina se utiliza con mayor frecuencia durante 72 horas; luego, se toma un frotis, se tiñe y se cuenta el número de blastos. El índice de estimulación es la relación entre el porcentaje de células transformadas en el experimento (cultivo con fitohemaglutinina) y el porcentaje de células transformadas en el control (cultivo sin fitohemaglutinina). La reacción de transformación de blastos linfocitarios puede evaluarse mediante la inclusión de un marcador radiactivo (ZN-thymndinum) en las células cultivadas, ya que la síntesis de ADN aumenta durante la división celular. Las alteraciones en la respuesta proliferativa ocurren tanto en inmunodeficiencias primarias como secundarias asociadas con infecciones, cáncer, insuficiencia renal e intervenciones quirúrgicas.
  • En estos estudios, se evalúa la expresión de marcadores de activación (CD25, receptor de transferrina - CD71) y la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad clase II HLA-DR, prácticamente ausentes en los linfocitos T en reposo. Los linfocitos T se estimulan con fitohemaglutinina y, tras 3 días, se analiza la expresión de los marcadores de activación mediante inmunofluorescencia directa o indirecta, citofluorometría de flujo, utilizando anticuerpos monoclonales contra los receptores aislados.
  • Medición de la cantidad de mediadores sintetizados por los linfocitos T activados [interleucina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, interferón γ, etc.] mediante radioinmunoensayo o ELISA. Es de especial importancia evaluar la concentración de interferón γ e IL-4 como marcadores de Th1 y Th2 en el sobrenadante de cultivos activados y en el interior de la célula. De ser posible, resulta útil determinar la expresión génica de la citocina correspondiente mediante el nivel de ácido ribonucleico de la matriz en la célula productora y la intensidad de la expresión de los receptores para las citocinas correspondientes.
    
• Reacción de inhibición de la migración linfocitaria. Los linfocitos T sensibilizados, al reaccionar con el antígeno, secretan linfocinas, incluyendo factores que inhiben la migración linfocitaria. Este fenómeno de inhibición se observa al introducir mitógenos en el cultivo celular. La evaluación del grado de inhibición permite evaluar la capacidad de los linfocitos para secretar citocinas. Normalmente, la frecuencia de migración, dependiendo del mitógeno específico, es del 20 al 80 %.
• Evaluación de la citotoxicidad de las células NK. Se determina la capacidad de las células asesinas naturales (NK) para destruir células diana de la línea eritromieloide K-562. Si se evalúa la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, se utilizan células diana recubiertas con anticuerpos IgG. Las células diana se marcan con 3H-uridina y se incuban con células efectoras. La muerte de las células diana se evalúa mediante la liberación del marcador radiactivo en la solución. En las neoplasias malignas, se observa una disminución de la citotoxicidad. En algunos casos, cuando es necesario predecir la eficacia del tratamiento con interleucinas, se evalúa la citotoxicidad de las células NK durante la incubación con ciertas citocinas.

Estudio de la función de los fagocitos

Métodos de detección

Estudio de la intensidad de la absorción de células microbianas por los fagocitos (fagocitosis de partículas de látex, cultivo de prueba de estafilococos, E. coli o microorganismos aislados del paciente). Mediante centrifugación de sangre heparinizada, se aísla una suspensión de leucocitos y se añade suero del grupo sanguíneo IV para su opsonización (las opsoninas son proteínas que favorecen la fagocitosis). La suspensión microbiana se diluye, se mezcla con leucocitos y se incuba durante 120 minutos, tomando muestras para análisis 30, 90 y 120 minutos después del inicio de la incubación. Se realizan frotis de la suspensión de leucocitos recolectada. Se determinan los siguientes indicadores de fagocitosis:

• índice fagocítico: porcentaje de células que entraron en fagocitosis dentro de los 30 minutos y 120 minutos de incubación; el valor estándar del índice fagocítico (30) es del 94%, el índice fagocítico (120) es del 92%;
• número fagocítico: número promedio de bacterias ubicadas intracelularmente; el valor estándar del número fagocítico (30) es del 11%, el número fagocítico (120) es del 9,8%;
• coeficiente de número fagocítico: relación entre el número fagocítico (30) y el número fagocítico (120); normalmente 1,16;
• Índice bactericida de los neutrófilos: relación entre el número de microbios eliminados dentro de los fagocitos y el número total de microbios absorbidos; normalmente es del 66 %.

Métodos de clarificación

• Estudio de la capacidad bactericida de los fagocitos en la prueba con nitroazul de tetrazolio (NBT) - Prueba NBT. Se añade el colorante amarillo nitroazul de tetrazolio a los leucocitos. Cuando un neutrófilo absorbe el colorante, se produce un proceso de reducción por la influencia de los radicales libres de oxígeno, lo que resulta en una coloración azul. La reacción se lleva a cabo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se añade solución de Hanks (NBT espontáneo) a los tres primeros pocillos con una mezcla de NBT y leucocitos, y se añaden partículas de látex al segundo; la mezcla se incuba a 37 °C durante 25 min. Los resultados se leen a 540 nm en un lector y se expresan en unidades arbitrarias. Se calcula el coeficiente de estimulación (K _st ), que es igual a la relación entre la densidad óptica en los pocillos estimulados y la densidad óptica media en los pocillos sin estimulación. En personas sanas, NBT _espontánea = 90 ± 45 CU, NBT _estimulada = 140 ± 60 CU. Punto _derecho = 1,78±0,36.
• Estudio de moléculas de adhesión. La citofluorometría de flujo se utiliza para determinar la expresión de los antígenos de superficie CD11a/CD18, CD11b/CD18 y CD11c/CD18. Las inmunodeficiencias con deterioro de la adhesión se manifiestan por infecciones recurrentes, cicatrización lenta de heridas y ausencia de pus en los focos de infección.

Estudio del sistema del complemento

Métodos de detección

La determinación de la actividad hemolítica del complemento es un estudio de la vía clásica de activación del complemento. Se añaden diferentes diluciones de suero de una persona enferma y sana a eritrocitos de carnero recubiertos con anticuerpos. La unidad de actividad hemolítica es el recíproco de la dilución sérica a la que se destruye el 50% de los eritrocitos. El grado de hemólisis se estima fotométricamente por la liberación de hemoglobina en la solución. Se observa una disminución de la actividad hemolítica del complemento en el lupus eritematoso sistémico con daño renal, glomerulonefritis aguda, inmunodeficiencias combinadas, miastenia, hepatitis viral, linfomas, un aumento de la ictericia obstructiva, tiroiditis de Hashimoto, reumatismo, artritis reumatoide, periarteritis nodular, dermatomiositis, infarto de miocardio, colitis ulcerosa, síndrome de Reiter, gota.

Métodos de clarificación

• Determinación de los componentes del complemento. La determinación cuantitativa se realiza mediante inmunodifusión radial y nefelometría.
  El estudio no es informativo a menos que se alteren las propiedades antigénicas de los componentes del complemento.
• Se ha establecido que el componente Clq del complemento potencia la fagocitosis y media la citotoxicidad celular. Su disminución se observa en enfermedades por inmunocomplejos, lupus eritematoso sistémico, infecciones purulentas y tumores.
• El componente C3 participa en la activación de las vías clásica y alternativa del complemento. Una disminución de su concentración se asocia con infecciones bacterianas y fúngicas crónicas y con la presencia de inmunocomplejos circulantes o tisulares.
• El componente C4 participa en la activación de la vía clásica. Una disminución de su concentración se asocia con una activación prolongada del complemento por inmunocomplejos y una disminución de la concentración del inhibidor de C1, que controla la activación de la vía clásica del complemento. La deficiencia de C4 se presenta en el lupus eritematoso sistémico, mientras que su aumento se produce en la enfermedad renal, el rechazo de trasplantes, la inflamación aguda y las enfermedades gastrointestinales.
• C5a es un pequeño fragmento de la molécula C5, que se desprende de ella como resultado de la activación del sistema del complemento. Su concentración aumenta durante la inflamación, la sepsis y las enfermedades atópicas y alérgicas.
• El inhibidor de Cl es un factor multifuncional. Controla la activación del componente C1 del complemento e inhibe la actividad de la calicreína, la plasmina, el factor de Hageman activado y las proteasas Cls y Or. La deficiencia del inhibidor de C1 provoca angioedema.
• Estudios funcionales del complemento. El suero problema se añade a un suero estándar sin complemento y se determina su actividad hemolítica. Si la actividad hemolítica no se normaliza, se considera que la actividad de este complemento en el suero problema está reducida.

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