Investigación inmunológica en urología

La asignación de un inmunograma a un paciente urológico significa que el médico tratante asume la presencia de alteraciones en el sistema inmune. Duplicar,, infecciones por hongos virales bacterianas, reacciones alérgicas, enfermedades sistémicas pueden ser síntomas de estos trastornos, que se caracterizan por una serie de síndromes (infección, cáncer, alérgicas, autoinmunes, linfoproliferativo). Un paciente puede tener varios síndromes. Por ejemplo, las enfermedades infecciosas crónicas (síndrome infeccioso) pueden causar inmunodeficiencia, y la inmunodeficiencia puede manifestarse por una predisposición a enfermedades infecciosas y oncológicas (síndrome oncológico). La predisposición a las infecciones puede ocurrir en un contexto de inmunodeficiencia secundaria, que se desarrolló como resultado de una enfermedad linfoproliferativa, por ejemplo, leucemia. Hay tres grupos principales de cambios patológicos en el sistema inmune:

• la insuficiencia cuantitativa o funcional de uno u otro eslabón de inmunidad, que conduce al desarrollo de un estado de inmunodeficiencia;
• una violación en el reconocimiento del antígeno por el sistema inmune, lo que lleva al desarrollo de procesos autoinmunes;
• respuesta inmune hiperreactiva o "pervertida", manifestada por el desarrollo de enfermedades alérgicas.

Hay métodos de detección (pruebas de nivel 1) y calificación (pruebas de 2 niveles) de inmunodiagnóstico. Los primeros existen para corregir violaciones en el sistema inmune, el segundo - para establecer los mecanismos implicados en su implementación con el fin de una mayor inmunocorrección.

B-enlace celular de la inmunidad

Métodos de detección

• Determinación del número relativo y absoluto de los linfocitos B a través de inmunofluorescencia o citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales para antígenos de células B (CD19, CD20, en donde CD - grupo de diferenciación). El contenido de linfocitos B es normal en adultos: 8-19% del número total de leucocitos o 190-380 células / μl. Se produce un aumento en los niveles de linfocitos B con infecciones bacterianas y fúngicas agudas y crónicas, enfermedades hepáticas crónicas, enfermedades sistémicas del tejido conjuntivo, leucemia linfocítica crónica, mieloma.
• Determinación de la concentración de inmunoglobulinas nespespetsificheskih (F, M, G, E) por inmunodifusión radial simple, o nefelometría turbometrii, radioinmunoensayo o inmunoensayo enzimático (EIA). Normas para adultos: inmunoglobulina (Ig) A 0.9-4.5 g / l. IgM 03-3.7 g / l. IgG 8.0-17 g / l. Se produce un aumento en la concentración de inmunoglobulinas con las mismas condiciones patológicas en las que se produce un aumento en el contenido de linfocitos B. La reducción de la concentración de inmunoglobulinas se encuentra en hipogammaglobulinemia congénita, tumores del sistema inmune, la eliminación del bazo, la pérdida de proteínas, en las enfermedades de los riñones o los intestinos, el tratamiento con citostáticos y immunodepreesantami.

Especificando métodos

• Determinación de inmunocomplejos circulantes en la sangre mediante precipitación selectiva en polisileneglicol seguida de una prueba de densidad espectrofotométrica (UE 80-20 normal). El aumento de inmunocomplejos circulantes es característico para infecciones bacterianas, fúngicas, víricas, autoinmunes, enfermedades inmunocomplejas, enfermedad del suero, reacciones alérgicas de tipo 3;
• Determinación de inmunoglobulinas específicas en la sangre en relación a antígenos bacterianos y virales, el ácido desoxirribonucleico (ADN) en las enfermedades autoinmunes, la identificación de los espermatozoides (infertilidad autoinmune) y anticuerpos protivopochechnyh (pielonefritis y glomerulonefritis) por inmunodifusión radial o ELISA.
• Determinación de anticuerpos antiespermáticos en los espermatozoides [prueba MAR (reacción antiglobulina mixta)], la norma es negativa.
• Determinación de la concentración de inmunoglobulinas en orina para el diagnóstico diferencial entre pielonefritis y glomerulonefritis (selectividad de proteinuria).
• Determinación de IgE en el jugo de próstata para el diagnóstico de prostatitis alérgica mediante inmunodifusión radial o ELISA. 
• La investigación en reacción blasttransformation respuesta de los linfocitos B en un mitógeno de las células B (mitógeno de hierba carmín para la estimulación de la reacción blasttransformation de linfocito B en presencia de linfocitos T), en el que el valor estándar de 95-100%.

Enlace de inmunidad de células T

Métodos de detección

• Determinación del número relativo y absoluto de la reacción de linfocitos maduros CD3 T por inmunofluorescencia o fluir citofluorometría utilizando anti-SDZ anticuerpos monoclonales. La norma para adultos es 58-76% o 1100-1700 células / μl. La disminución en el número de linfocitos T es un indicador de la insuficiencia del enlace celular de la inmunidad. Esto es característico de varias inmunodeficiencias secundarias y primarias (infecciones bacterianas y virales crónicas: tuberculosis, adquirió el síndrome de deficiencia inmune, cáncer, insuficiencia renal crónica, trauma, estrés, envejecimiento, malnutrición, tratamiento con fármacos citotóxicos, la radiación ionizante). Aumentar el número de linfocitos T es contra el fondo de la hiperactividad inmune o enfermedades linfoproliferativas. Con la inflamación, el número de linfocitos T primero aumenta y luego disminuye. La ausencia de una disminución en los linfocitos T sugiere la crónica del proceso inflamatorio.
• Evaluación de las subpoblaciones de linfocitos.
  • Determinación del número de T-helpers (anticuerpo anti-CD4). Normalmente, 36-55% o 400-1100 células / μl. Un aumento en el número de estas células ocurre en enfermedades autoinmunes, enfermedad de Waldenstrom, activación de la implantación antigrafito; reducción en el número de células T auxiliares se produce en,, infecciones crónicas bacterianas virales por protozoos, tuberculosis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, malignidades, quemaduras, traumatismos, desnutrición, el envejecimiento, tratamiento citostáticos, radiaciones ionizantes.
  • Determinación del número de supresores de T (anticuerpo anti-CD4). Normalmente, 17-37% o 300-700 células / μl. Se produce un aumento en el número de supresores T con las mismas condiciones en las que disminuye el número de T-helpers, y su disminución en las mismas condiciones, cuando aumenta el contenido de T-helpers.
  • Índice de inmunoregulación CD4 / CD8, en la norma 1,5-2,5. Hiperactividad a tasas superiores a 2.5 (enfermedades alérgicas y autoinmunes); hipoactividad: menos de 1.0 (predisposición a infecciones crónicas). Al inicio del proceso inflamatorio, el índice inmunorregulador aumenta, y cuando disminuye, se normaliza.

Especificando métodos

• Determinación del número de asesinos naturales (células NK) - anticuerpos anti-CD16 y anti-CD56. La norma para CD 16-linfocitos es 6-26%, CD56 - 9-19%. Aumentar el número de células NK se produce en el rechazo del injerto, disminuir - en las infecciones virales, el cáncer, inmunodeficiencias primarias y secundarias, quemaduras, trauma y estrés, el tratamiento con citostáticos y la radiación ionizante. 
• Determinación del número de linfocitos T con el receptor para interleucina-2 (marcador de activación) - anticuerpos anti-CD25. La norma es 10-15%. Se observa un aumento en su número en enfermedades alérgicas, rechazo de trasplantes, respuesta a antígenos dependientes del timo en el período agudo de infección primaria, disminución de las mismas enfermedades en las que disminuye el número de células NK.
• Examen de la expresión del marcador de activación - la molécula de histocompatibilidad de clase II HLA-DR. La expresión aumentada ocurre en procesos inflamatorios, en pacientes con hepatitis C, enfermedad celíaca, sífilis, infecciones respiratorias agudas.
• Evaluación de la apoptosis de linfocitos. Una indicación de la disposición de la apoptosis de linfocitos puede ser identificado por su expresión de superficie de Fas-receptor (CD95) en las mitocondrias y bd-2 protooncogén. La apoptosis se evaluó por procesamiento de linfocitos dos colorantes fluorescentes: yoduro de propidio, que se une a los fragmentos de ADN y la anexina Y, la unión a fosfatidilserina en la membrana celular que aparecen en apoptosis temprana. La evaluación de los resultados se lleva a cabo en un citofluorímetro de flujo. El cálculo de los resultados se basa en la proporción de células teñidas con diversos tintes. Las células no teñidas son células viables, asociados sólo con la anexina la Y, - los primeros signos de apoptosis, con yoduro de propidio y anexina I - manifestaciones tardías de la apoptosis, la tinción de yoduro de propidio solamente indica necrosis.
• Evaluación de la proliferación de linfocitos T in vitro.
  • El cambio en la blastogénesis celular es una reacción de la transformación de blastos de linfocitos. Los leucocitos se incuban con cualquier mitógeno de origen vegetal (lectinas). Fitohemaglutinina utilizada más comúnmente durante 72 horas, luego realice una prueba, tíñela y cuente el número de blastos. El índice de estimulación es la relación entre el porcentaje de células transformadas en el experimento (cultivo con fitohemaglutinina) y el porcentaje de células transformadas en el control (cultivo sin fitohemaglutinina). La reacción de la transformación de blastos de los linfocitos se puede evaluar mediante la inclusión de un marcador radiactivo (ZN-timidina) en células cultivadas, ya que la síntesis de ADN aumenta al dividir las células. Las alteraciones en la respuesta proliferativa ocurren tanto en inmunodeficiencias primarias como secundarias asociadas con infecciones, enfermedades oncológicas, insuficiencia renal e intervenciones quirúrgicas.
  • La evaluación de estos estudios, la expresión de marcadores de activación (CD25, receptor de la transferrina a - CD71) moléculas y el MHC de clase II HLA-DR, que son sustancialmente ausente en la reclinación de linfocitos T. Los linfocitos T estimulados con fitohemaglutinina después de 3 días marcadores de activación de expresión se analizaron por inmunofluorescencia directa o indirecta, citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales receptores secretados.
  • Medir la cantidad de mediadores sintetizada por linfocitos T activados [interleucina (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, gamma-interferón, etc.], por radioinmunoensayo o ELISA. Es especialmente importante la evaluación de la concentración de interferón y de IL-4 como marcadores de TH y Th2 en el sobrenadante de cultivos activados y dentro de la célula. Si es posible, es útil para determinar la expresión del gen de la citoquina relevante por el nivel de ácido ribonucleico mensajero en la treonina producir intensidades celular y la expresión del receptor para las respectivas citoquinas.
    
• La reacción de la inhibición de la migración de los linfocitos. Los linfocitos T sensibilizados en la reacción con el antígeno liberan linfocinas, incluidos los factores. Inhibiendo la migración de linfocitos. El fenómeno de la inhibición se observa cuando los mitógenos se introducen en el cultivo de las células. La evaluación del grado de inhibición permite juzgar la capacidad de los linfocitos para liberar citoquinas. Normalmente, la frecuencia de la migración, dependiendo del mitógeno específico, es del 20-80%.
• Evaluación de la citotoxicidad de las células NK. Determine la capacidad de las células asesinas naturales para matar las células diana de la línea eritromieloide K-562. Si se evalúa la citotoxicidad dependiente de anticuerpo, se usan células diana recubiertas con anticuerpos IgG. Las células diana se marcan con 3H-uridina y se incuban con células efectoras. La muerte de las células diana se estima a partir de la liberación de la etiqueta radioactiva en la solución. La reducción de citotoxicidad ocurre con neoplasmas malignos. En algunos casos, cuando se requiere un pronóstico de la efectividad del tratamiento con interleucinas, la citotoxicidad de las células NK se evalúa cuando se incuba con ciertas citoquinas.

Investigación de la función de los fagocitos

Métodos de detección

Investigación de la absorción de células microbianas por fagocitos (fagocitosis de partículas de látex, cultivo de prueba de estafilococos, Escherichia coli o microorganismos aislados del paciente). Al centrifugar la sangre heparinizada, se aísla una suspensión de leucocitos, se agrega suero del grupo sanguíneo IV para la opsonización (las opsoninas son proteínas que potencian la fagocitosis). La suspensión microbiana se diluye, se mezcla con leucocitos y se incuba durante 120 min, tomando muestras para el análisis después de 30,90.120 minutos después del inicio de la incubación. De las suspensiones de leucocitos seleccionadas hacer frotis. Determine los siguientes indicadores de fagocitosis:

• índice fagocítico: el porcentaje de células que ingresaron a la fagocitosis en 30 minutos y 120 min de incubación; valor normativo del índice fagocítico (30) 94% del índice fagocítico (120) - 92%;
• número fagocítico: el número promedio de bacterias que son intracelulares; el valor normativo del número fagocítico (30) 11%, número fagocítico (120) - 9.8%;  
• coeficiente de número fagocítico - relación de número fagocítico (30) a número fagocítico (120); normal 1.16;
• el índice bactericida de neutrófilos es la relación entre el número de microbios muertos dentro de los fagocitos y el número total de microbios absorbidos; en la norma del 66%.

Especificando métodos

• La prueba de la actividad bactericida de los fagocitos en la prueba con nitrosine tetrazolium (NST) es la prueba NST. A los leucocitos se les agrega tinte de amarillo de tetrazolio nitroso. Cuando el colorante es absorbido por el neutrófilo, el proceso de reducción se lleva a cabo bajo la acción de radicales libres de oxígeno, lo que resulta en una tinción azul. La reacción se lleva a cabo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. En los primeros tres pocillos con una mezcla de HCT y leucocitos, se agrega la solución de Hanks (HCT espontáneo), en este último - partículas de látex; incubar a 37 ° C durante 25 minutos. Los resultados se leen a 540 nm en el lector y se expresan en unidades convencionales. Calcule el factor de estimulación (K _st ), igual a la relación de densidad óptica en los pozos estimulados a la densidad óptica promedio en los pocillos sin estimulación. En personas sanas, _{HCT spont} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Investigación de moléculas de adhesión. Con la ayuda de la citofluorimetría de flujo, se determina la expresión de los antígenos de superficie CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Las inmunodeficiencias con violación de la adhesión se manifiestan por infecciones recurrentes, curación lenta de heridas y ausencia de pus en los focos de infección.

Investigación del sistema de complemento

Métodos de detección

Determinación de la actividad hemolítica del complemento: estudio de la vía clásica de activación del complemento. Se añaden diferentes diluciones del suero del paciente y una persona sana a los eritrocitos de una oveja recubierta con anticuerpos. Se toma una unidad de actividad hemolítica como la inversa de la dilución de suero, en la que se destruye el 50% de los eritrocitos. El grado de hemólisis se evalúa fotométricamente por el rendimiento de hemoglobina en la solución. La reducción de la actividad hemolítica del complemento se observa en el lupus eritematoso sistémico con afectación renal, glomerulonefritis aguda. Inmunodeficiencias combinadas, miastenia gravis, hepatitis viral, linfomas, aumento - con ictericia obstructiva, tiroiditis Hashimoto. Reumatismo, artritis reumatoide, periarteritis nodular. Dermatomiositis, infarto de miocardio, colitis ulcerosa, síndrome de Reiter, gota.

Especificando métodos

• Determinación de los componentes del complemento. La determinación cuantitativa se lleva a cabo mediante el método de inmunodifusión radial y nefelometría.
  El estudio no es informativo, a menos que se cambien las propiedades antigénicas de los componentes del complemento.
• Se encontró que el componente Clq del complemento potencia la fagocitosis y media la citotoxicidad celular. Su disminución se produce en enfermedades de complejos inmunes, lupus eritematoso sistémico, infecciones purulentas y tumores.
• El componente C3 participa en la activación de la vía clásica y alternativa del complemento. La reducción de su concentración se asocia con infecciones bacterianas y fúngicas crónicas, la presencia de complejos inmunes circulantes o tisulares.
• El componente C4 participa en la activación de la vía clásica. La reducción de su concentración se asocia con una activación prolongada del complemento por complejos inmunes y una disminución en la concentración del inhibidor C1, que controla la activación de la vía clásica del complemento. La deficiencia de C4 ocurre con el lupus eritematoso sistémico; se produce un aumento de C4 con la enfermedad renal, el rechazo de trasplantes, la inflamación aguda y las enfermedades del tracto gastrointestinal.
• C5a es un pequeño fragmento de la molécula C5, separada de él como resultado de la activación del sistema del complemento. El aumento en su concentración ocurre con inflamación, sepsis, enfermedades atópicas y alérgicas.
• Cl-inhibitor es un factor multifuncional. Controla la activación del componente C1 del complemento, inhibe la actividad de calicreína, plasmina y factor activado Hageman, proteasas Cl y Or. La deficiencia de C1-inhibidor conduce a angioedema.
• estudios complementarios. Para el suero estándar que carece de cualquier componente del complemento, se agrega suero de prueba y se determina la actividad hemolítica del complemento. Si la actividad hemolítica no se restablece a la normalidad, se cree que la actividad de este componente del complemento en el suero de prueba se reduce.

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