Modelos experimentales de osteoartritis

El cartílago es un tejido altamente especializado que contiene solo un tipo de células (condrocitos), que se caracteriza por la ausencia de vasos sanguíneos y linfáticos. La nutrición del cartílago se lleva a cabo principalmente por absorción del líquido sinovial. El metabolismo de los condrocitos está regulado por una serie de factores solubles producidos localmente por los condrocitos y los tejidos circundantes. La función de los condrocitos también depende de la composición del medio extracelular (tensión de oxígeno, concentración de iones, pH, etc.), composición de VCM, interacción de células y matriz, señales físicas. La tarea principal del modelado experimental es la creación de cultivos en el entorno extracelular sin cambiar el fenotipo de las células maduras. La segunda tarea es crear cultivos para estudiar la respuesta prematura, retrasada, a corto o largo plazo de los condrocitos a señales químicas y / o físicas. Los estudios in vitro también proporcionan una oportunidad para estudiar el comportamiento de los condrocitos en la osteoartritis. La tercera tarea es el desarrollo de sistemas co-curativos, que permiten estudiar las interacciones de varios tejidos en la articulación. La cuarta tarea es la preparación de implantes cartilaginosos para el posterior trasplante. Y, finalmente, la quinta tarea es estudiar factores de crecimiento, citoquinas o agentes terapéuticos que sean capaces de estimular la reparación y / o inhibir su resorción del cartílago.

En las últimas décadas, se han creado varios modelos de cultivos de células de cartílago articular, que incluyen cultivos en monocapa, cultivos suspendidos, cultivos de condón, explantes, cocultivos, cultivos de células inmortales. Cada cultura tiene sus ventajas y desventajas y cada una es adecuada para estudiar un aspecto particular del metabolismo de condrocitos. Por lo tanto, los explantes cartilaginosos son un excelente modelo para estudiar el recambio de los elementos de la matriz, lo que requiere receptores genuinos de la superficie celular y las interacciones normales célula-matriz y matriz-célula. Al mismo tiempo, se recomienda llevar a cabo el estudio de los depósitos en la matriz o los mecanismos para la regulación del metabolismo de los condrocitos en un cultivo de células aisladas. Es necesario un cultivo monocapa de baja densidad para estudiar el proceso de diferenciación celular. Los cultivos suspendidos en una matriz natural o sintética son un modelo para analizar la respuesta adaptativa de los condrocitos al estrés mecánico.

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Cultivos de condrocitos

Al elegir tejido de cartílago para estudios in vitro, se deben considerar varios puntos importantes. La composición de la matriz y la actividad metabólica de los condrocitos varían en diferentes articulaciones, y la última también depende de la profundidad de los condrocitos en el tejido. Estos datos se obtuvieron en varios experimentos en los que se estudiaron subpoblaciones aisladas de condrocitos de las zonas del cartílago de diferentes profundidades. Se encontraron varias diferencias morfológicas y bioquímicas entre los condrocitos cultivados localizados en la superficie y las capas profundas del cartílago articular. Las células superficiales sintetizan una matriz fibrilar de proteoglicanos escasa y agotada, mientras que las células más profundas producen una matriz que es rica en fibrillas y proteoglicanos. Además, las células superficiales producen relativamente más pequeños proteoglicanos no agregadas y ácido hialurónico y aggrecan y sulfato de queratano relativamente más pequeño, los condrocitos más profundamente situados. Otra característica distintiva importante del metabolismo de los condrocitos aislados de las zonas del cartílago de diferentes profundidades es la respuesta al estímulo exógeno. Según M. Aydelotte y sus coautores, los condrocitos de toro de la zona superficial del cartílago eran más sensibles a la IL-1 que las células de la zona profunda.

El comportamiento de las células también depende de la ubicación del tejido. Los condrocitos del cartílago y del oído bordes, tomadas del mismo animal que reaccionan de manera diferente a los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y TGF-beta. El FGF aumentó la incorporación de timidina, prolina y leucina en el cultivo de condrocitos de la costilla, pero no en el oído. TGF-P aumento de la incorporación de timidina en los condrocitos del cartílago de costilla y el oído, pero no tuvo efecto sobre la incorporación de timidina en condrocitos y oído prolina. Las células de cartílago obtenidas de las zonas que tienen la carga más grande difieren de las de los sitios con una carga baja en el cartílago. Por ejemplo, los condrocitos maduros del cartílago de la articulación de la rodilla de la región central de la superficie del hueso tibial ovejas articular no cubiertos por el menisco, que lleva la mayor carga in vivo, aggrecan sintetizado más pequeño, decorin pero más grande que las células de las áreas cubiertas por el menisco. Los autores también enfatizan la importancia de usar cartílago de zonas articulares idénticas cuando se examina la función sintética de las articulaciones.

El metabolismo de los condrocitos y la respuesta a los factores de regulación también depende en gran medida de la edad del donante, el desarrollo de su esqueleto y salud de las articulaciones, de los que toman las células. En los condrocitos humanos, se observa una disminución significativa con la edad de la respuesta proliferativa. La mayor disminución se observa en donantes de 40-50 años y mayores de 60 años. Además, la gravedad de la respuesta proliferativa a los factores de crecimiento (por ejemplo, FGF y TGF-beta) disminuye durante el envejecimiento. Además de los cambios cuantitativos en la proliferación de condrocitos, también hay cambios cualitativos. Las células donantes jóvenes (10-20 años) responden mejor al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que al TGF-beta, mientras que lo contrario se observa en las células donantes adultas. Para explicar los cambios dependientes de la edad en la función sintética de los condrocitos y su respuesta al efecto de los factores de crecimiento, se utilizan varios mecanismos. Entre ellos, la reducción en el receptor número y la afinidad a la superficie celular, el cambio de la síntesis y la bioactividad de los factores de crecimiento y citoquinas posreceptor señales de modificación.

La condición patológica de las articulaciones también altera la morfología y la actividad metabólica de los condrocitos. Por lo tanto, J. Kouri y sus coautores (1996) identificaron tres subpoblaciones de condrocitos en el cartílago con osteoartritis. Los condrocitos de la mitad superior e intermedia del cartílago forman grupos y sintetizan más proteoglicanos y colágeno. TGF-beta, y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) pueden estimular la síntesis de proteoglicanos por los condrocitos y parcialmente neutralizar los efectos de IL-1 y TNF-a. Explantes de cartílago fueron afectados por la osteoartritis, y los condrocitos aislados de cartílago de pacientes con osteoartritis, son más sensibles a la estimulación de TGF-beta de los condrocitos del cartílago sano. Estas diferencias probablemente se asocien con cambios fenotípicos en los condrocitos en las capas superiores del cartílago articular.

El aislamiento de condrocitos individuales se logra por tratamiento secuencial con enzimas proteolíticas de ECM. Después de su liberación de la ECM, las células aisladas son ideales para estudiar la síntesis de componentes de la matriz de novo. Algunos autores usan solo clostridium colagenasa, otros preincuban el cartílago con tripsina, pronasa, ADNasa y / o hialuronidasa. La cantidad de células aisladas depende de las enzimas utilizadas. Por lo tanto, cuando se procesa una de 1 g de tejido de colagenasa se puede obtener 1,4T0 ⁶ condrocitos, mientras que cuando se utiliza pronasa, hialuronidasa y colagenasa - 4,3-10 ⁶. Cuando se procesa con colagenasa, agrecano, proteínas, IL-6, IL-8 permanecen en el cultivo celular mucho más que en el caso del tratamiento secuencial con diversas enzimas. Hay varias explicaciones para estas diferencias entre los dos cultivos celulares:

• receptores celulares dañadas o deprimido por la acción de enzimas, TGF-beta inhibe la síntesis de ADN de los proteoglicanos en los condrocitos recién aislados (día 1), mientras que el ADN y la síntesis de proteoglicanos de los condrocitos cultivados en monocapa (7 días) estimuladas por TGF-beta. Sin embargo, para volver a expresar estos componentes de la membrana, se requiere un período adecuado antes del inicio del experimento.
• Las proteasas exógenas pueden romper la interacción de las células y la matriz, mediada por integrinas. La familia de integrinas promueve la unión de condrocitos a moléculas de VKM (Shakibaei M. Et al., 1997). Esta ruptura puede afectar la expresión de los genes de la matriz.
• Los residuos de los componentes de la matriz pueden regular la función sintética de los condrocitos. Las integrinas pueden reconocer los productos de degradación de la MEC, desempeñando así un papel importante en la reparación de los tejidos después de la exposición a las enzimas proteolíticas. T. Larsson et al (1989) informaron de que la adición de proteoglicanos intactas o fragmentados en células cultivadas estimula la síntesis de proteínas y proteoglicanos. Sin embargo, altos niveles de ácido hialurónico causa una reducción significativa en la inclusión de la síntesis de proteoglicanos por los condrocitos sulfato de condrocitos de embrión de pollo maduro células de porcino y de condrosarcoma de rata. Además, el ácido hialurónico - inhibidor de la liberación de proteoglicano a partir de las células, incluso en presencia de IL-lb, TNF-a, FGF, lo que indica que la primera contrarrestar la actividad biológica de factores de crecimiento y citoquinas. El mecanismo exacto que subyace a la acción del ácido hialurónico sigue sin estar claro; Se sabe que los condrocitos contienen un receptor para el ácido hialurónico, asociado con los filamentos de actina del citosol. La unión del ácido hialurónico a su receptor estimula la fosforilación de las proteínas. Por lo tanto, estos datos demuestran la modulación de la función metabólica de los condrocitos por moléculas fragmentadas o nativas de proteínas de la matriz mediante la activación de las células receptoras de la membrana.
• La estimulación rápida por enzimas de la síntesis de proteínas de la matriz por condrocitos puede ser una consecuencia de un cambio en la forma de los condrocitos y / o la reorganización del citoesqueleto.
• Algunas citoquinas (p. Ej., IL-8) y factores de crecimiento (p. Ej., IGF-1, TGF-P) se fijan en la MEC. El ejemplo más conocido es la unión de TGF-beta con decore, que conduce a una disminución en la capacidad de los primeros para inducir el crecimiento celular en células ováricas en hamsters chinos. Los datos de que el contenido de la decoración del cartílago aumenta con la edad, indican una disminución en la biodisponibilidad de TGF-beta en el envejecimiento. Los factores de crecimiento y las citoquinas se pueden liberar de los residuos de la matriz durante el cultivo y luego modular la función de los condrocitos.

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Cultivo monocapa de condrocitos

El fenotipo diferenciado de condrocitos se caracteriza principalmente por la síntesis de colágeno tipo II y proteoglicanos específicos de tejido, así como un bajo nivel de actividad mitótica. Hay pruebas de que el cultivo a largo plazo de células en una monocapa, y después de varios pasajes repetidos de las células, los condrocitos pierden su forma esférica, se convierten en forma alargada, similar a fibroblastos. Con la función sintética tal fibroblastos metaplasia también se modifica células, caracterizados por una disminución progresiva en la síntesis de los colágenos II, IX y XI tipos y la mejora de la síntesis de colágeno I, III y Utipov. Los pequeños proteoglicanos no agregados se sintetizan mediante agrecano funcional. Synthetzatepsin B y L es extremadamente bajo en células diferenciadas, pero en el proceso de pérdida de diferenciación aumenta. La colagenasa-1 se expresa en los condrocitos diferenciados durante el cultivo prolongado su expresión se reduce mientras que la producción aumentada de inhibidor de tejido de metaloproteasas (TIMP).

Los condrocitos diferenciados reexpresan el colágeno del fenotipo diferenciado cuando se transfieren de un cultivo monocapa a uno suspendido. El proceso de diferenciación probablemente esté relacionado con la forma de las células. Esta propiedad es utilizada regularmente por investigadores que estudian trasplantes defectuosos con condrocitos autólogos. Un pequeño número de células obtenidas de un material de biopsia puede multiplicarse en un cultivo de monocapa y luego colocarse de nuevo en una matriz tridimensional antes del trasplante. Re-expresión de un condrocitos desdiferenciados fenotipo específico migrados en la cultura de agarosa, puede ser estimulado por el ácido ascórbico y complejo hidroxiapatita TGF-p-oseína.

En respuesta al efecto de los factores de crecimiento y las citoquinas, los condrocitos se modifican durante el proceso de diferenciación. La respuesta celular a las citocinas y los factores de crecimiento difiere entre los condrocitos indiferenciados y diferenciados. IL-1 estimula la proliferación de fibroblastos, mientras que el crecimiento de condrocitos indiferenciados es inhibido por IL-1. La síntesis de ADN es estimulada por IGF-1 en condrocitos alargados, pero no aplanados. En los condrocitos diferenciados, los efectos estimulantes de IL-1β y TNF-α sobre los productos de procolagenasa son más pronunciados que en los indiferenciados.

Cultivo de condrocitos

El cultivo de condrocitos en suspensión en un medio líquido o en una matriz tridimensional natural o sintética estabiliza el fenotipo del condrocito. Las células conservan su forma esférica, sintetizan proteínas específicas de tejido. Por lo general, se recomienda un cultivo de condrocitos ponderados para el estudio de la formación de una nueva matriz pericelular. Los cultivos de condrocitos en polímeros absorbentes sintéticos o naturales se utilizan para implantar células en los defectos del cartílago para estimular la regeneración del tejido cartilaginoso de la articulación. El entorno sintético o natural para las células implantables debe cumplir una serie de requisitos:

• Los implantes deben tener una estructura porosa para la adhesión y el crecimiento celular,
• ni el polímero en sí ni los productos de su degradación deberían causar inflamación o reacciones tóxicas durante la implantación in vivo,
• el portador del trasplante debería poder unirse a un cartílago o hueso subcondral adyacente,
• una matriz natural o sintética debe ser capaz de absorberse, su degradación debe equilibrarse mediante regeneración tisular,
• Para facilitar la reparación del cartílago, la estructura química y la arquitectura de matriz de la matriz deberían ayudar a mantener el fenotipo celular codificado por los condrocitos y la síntesis de proteínas específicas de tejido.
• durante la implantación in vivo, es necesario estudiar las propiedades mecánicas de la matriz sintética o natural.

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Suspensión de condrocitos en la fase líquida

La unión celular a los vasos de plástico, en el que el cultivo de condrocitos se puede prevenir sus paredes recubiertas con una celulosa solución metilo, agarosa, hidrogel (poli-2-hidroxietilmetacrilato) o una mezcla de colágeno-agarosa. Bajo estas condiciones, los condrocitos forman grupos y sintetizan principalmente agrecano y colágenos específicos de tejido (tipos II, IX, XI). Por lo general, se encuentran dos tipos de células. Las células ubicadas en el centro conservan una forma esférica rodeada por una MEC bien desarrollada, lo que se confirma mediante estudios histoquímicos y ultraestructurales. En la periferia, los condrocitos tienen contornos discoides, están rodeados por una ECM rara; Poco se sabe sobre las características funcionales de tales células.

Es posible el cultivo de condrocitos en microvehículos soportados en suspensión; Se usan perlas de dextrano (citodex), perlas de dextrano recubiertas de colágeno (cytodex III), microesferas no vacías de colágeno tipo I (colágeno) como microvehículos. Bajo estas condiciones de cultivo, los condrocitos se unen a la superficie del microvehículo, conservan su forma esférica y producen un material similar a la matriz. Además, el uso de colágeno promueve la proliferación de condrocitos y la reexpresión de un fenotipo normal. Por lo tanto, el cultivo de condrocitos en las microesferas del colágeno se puede utilizar para restaurar el fenotipo celular antes del trasplante.

Otro método de cultivo de una suspensión de condrocitos en un medio líquido es su cultivo en forma de perlas densas que consisten en células (0.5-1 * 10 ^b ) obtenidas por centrifugación. Dichos condrocitos pueden producir una matriz que contiene una gran cantidad de proteoglicanos, colágeno tipo II, pero no colágeno de tipo I, que se confirma por métodos histológicos, inmunohistoquímicos y cuantitativos.

Suspensión de condrocitos en un ECM natural

Los condrocitos se pueden cultivar en suspensión en una matriz tridimensional (agar blando, agarosa, gel o esponja de colágeno, ácido hialurónico, cola de fibrina, perlas de alginato).

Los condrocitos de agarosa cultivados conservan su fenotipo normal y sintetizan colágeno tipo II y agregados agregados de agregados específicos de tejido. Cuando se cultivan en agarosa, los proteoglicanos sintetizados en células se liberan en el medio durante 50 días. Para comparación: en el cultivo en monocapa, la fase celular se sobrellena con glucosaminoglicanos ya en los primeros 5-6 días de cultivo; cuando se cultiva en el medio después de que se intensifica la síntesis y liberación de glicosaminoglicanos, la disminución dependiente del tiempo en glicosaminoglicanos ocurre en los primeros 8-10 días. Sin embargo, el comportamiento de los condrocitos durante su cultivo en agarosa difiere del de las condiciones in vivo. En agarosa, una gran cantidad de agregados Aggregan sintetizados contienen moléculas más pequeñas y más pequeñas que in vivo. TGF-P estimula la síntesis de proteoglicanos en el explante, pero reduce la síntesis de agrecano en agarosa.

El alginato es un polisacárido lineal derivado de algas pardas. En presencia de cationes divalentes, tales como ^iones Ca2 ⁺, este polímero se convierte en un gel. Cada condrocitos atrapado en alginato, rodeado por una matriz de polisacáridos cargados negativamente, los poros de las cuales son comparables con los de cartílago hialino. La matriz que se forma condrocitos en bolas de alginato, que consiste en dos segmentos - una fina capa de matriz asociada a las células correspondientes a las matrices pericelulares y territoriales de cartílago articular y más matriz remoto equivalente interterritorial en el tejido nativo. En el 30 día de cultivo, el volumen relativo y absoluto ocupada por las células, y cada uno de los dos departamentos de la esfera de alginato es casi completamente idénticos a los de cartílago nativo. Durante casi 30 días condrocitos conservan su forma esférica y producen propiedades aggrecan, hidrodinámicos que son similares a las de las moléculas de agrecano de la matriz de cartílago articular y el colágeno molécula II, IX y XI tipos. Al mismo tiempo, al igual que otros cultivos, suspensiones, perlas de alginato en la superficie de células aplanadas están presentes que generan una pequeña cantidad de colágeno de tipo I moléculas, lanzado directamente en el medio ambiente y no incorporadas a la VCR. En las cuentas de alginato, se observa una proliferación moderada de condrocitos. Después de 8 meses de cultivo en gel de alginato condrocitos maduros no pierden actividad metabólica y continúa para sintetizar específico de tejido colágeno tipo II y agrecano.

N. Tanaka y coautores (1984) investigaron las propiedades de difusión de varias moléculas naturales en el alginato y encontraron que las moléculas de más de 70 kD no se difunden a través del alginato. Por lo tanto, el cultivo de células en el alginato es adecuado para estudiar la regulación de la biosíntesis de la matriz y la organización de la MEC. La disponibilidad de células cultivadas en el alginato permite investigar el efecto de los factores reguladores peptídicos y los agentes farmacológicos en los niveles transcripcional, postranscripcional y translacional.

Los condrocitos también se cultivan en una matriz de fibras de colágeno tipos I y II. S. Nehrer y sus coautores (1997) compararon el funcionamiento de los condrocitos de perro en matrices poliméricas de colágeno-proteoglicano porosas que contienen colágenos de diferentes tipos. Encontraron diferencias importantes en la morfología de la función biosintética de condrocitos cultivados en matrices de colágeno que contienen colágeno tipos I y II. Las células en la matriz de colágeno tipo II enrollaron su forma esférica, mientras que en el colágeno tipo I, tenían una morfología similar a los fibroblastos. Además, en la matriz del colágeno tipo II, los condrocitos produjeron más glicosaminoglicanos. J. Van Susante et al (1995) compararon las propiedades de los condrocitos cultivados en el alginato y el gel de colágeno (tipo I). Los autores encontraron un aumento significativo en el número de células en el gel de colágeno, pero a partir del sexto día de cultivo, las células perdieron un fenotipo característico, convirtiéndose en células similares a fibroblastos. En el gel de alginato, se observó una disminución en el número de células, pero los condrocitos conservaron su fenotipo normal. La cantidad de proteoglicanos gel de colágeno por célula fueron significativamente más altos que en el alginato, pero no se observó la disminución de la síntesis de elementos de la matriz de gel a partir de la sexta días de cultivo, mientras que en la síntesis de alginato seguido creciendo.

Una matriz de fibrina tridimensional sólida es una sustancia natural que soporta los condrocitos pesados en ella en un fenotipo diferenciado. La matriz de fibrina 3D también puede usarse como un vehículo para el trasplante de condrocitos. Las ventajas de la fibrina son la ausencia de citotoxicidad, la capacidad de llenar el espacio, la capacidad adhesiva. Mediante estudios histológicos y bioquímicos, se ha encontrado que la autorradiografía, el microscopio electrónico, los condrocitos en el gel de fibrina retienen su morfología, se multiplican y producen una matriz incluso después de 2 semanas de cultivo. Sin embargo, G. Homminga y sus coautores (1993) informaron que después de 3 días de cultivo comienza la desintegración de la fibrina, la desdiferenciación de los condrocitos progresa.

Suspensión de condrocitos en un ECM artificial (sintético)

Los implantes de cartílago para cirugía reconstructiva u ortopédica se pueden obtener cultivando condrocitos aislados in vitro en una matriz sintética biocompatible.

Los condrocitos de ácido poliglicólico cultivados proliferan y mantienen una morfología y un fenotipo normales en 8 semanas. El complejo de condrocito-ácido poliglicólico consiste en células, glicosaminoglicanos, colágenos y tiene una cápsula externa de colágeno. Sin embargo, en dichos implantes hay dos tipos de moléculas de colágeno: I y II. Implantes de serie condrocitos desdiferenciados de pasajes tienen una mayor cantidad de glicosaminoglicanos y colágeno que en los implantes de condrocitos primarios indiferenciadas.

L. Freed y coautores (1 993b) compararon el comportamiento de los cultivos de condrocitos humanos y de toro en ácido poliglicólico fibroso (HPHC) y en ácido poliláctico (PPLC). Después de 6-8 semanas de cultivo de condrocitos de toro en HSVG o PPLC, los autores observaron la proliferación celular y la regeneración de la matriz del cartílago. En HSBC, los condrocitos eran esféricos, localizados en lagunas rodeadas por una matriz cartilaginosa. Después de 8 semanas de cultivo in vitro, el tejido regenerado contenía hasta 50% de materia seca (4% de masa celular, 15% de glicosaminoglicanos y 31% de colágeno). En PPLK las células tenían forma de huso, una pequeña cantidad de glicosaminoglicanos y colágeno. En HSBC, el crecimiento celular fue 2 veces más intenso que en PTCA. En condiciones in vivo, los condrocitos cultivados en HPVC y PPLC durante 1 a 6 meses produjeron un tejido histológicamente similar al cartílago. Los implantes contienen glucosaminoglicanos, colágenos tipo I y tipo II.

Los condrocitos de toro fetales se cultivaron en polietileno hidrofóbico e hidrofílico de alta densidad poroso. Después de 7 días de incubación en ambos sustratos, las células conservaron una forma esférica, que principalmente contiene colágeno de tipo II. Después de 21 días de cultivo, resultó que la matriz hidrófila contiene más colágeno de tipo II que la matriz hidrófoba.

El tejido del cartílago también se puede obtener cultivando en una monocapa en filtros Millicell-CM. El recubrimiento previo de los filtros con colágeno es necesario para la unión de los condrocitos. El examen histológico del cultivo demuestra la acumulación de condrocitos en la MEC que contiene proteoglicanos y colágeno tipo II. El colágeno tipo I en dicha cultura no se detecta. Los condrocitos en el tejido cartilaginoso resultante tienen una forma esférica, pero en la superficie del tejido están algo aplanados. El grosor del tejido recién formado aumentaba con el tiempo y dependía de la densidad inicial de la monocapa de células. En condiciones de cultivo óptimas, el grosor del tejido cartilaginoso alcanzó 110 μm, la organización de sus células y colágeno en la superficie y las capas profundas es similar a la del cartílago articular. VKM contiene aproximadamente 3 veces más colágeno y proteoglicanos. Después de 2 semanas de cultivo, se observó la acumulación de la matriz-sa, lo que permitió extraer el tejido del filtro y usarlo para el trasplante.

Sims et al. (1996) estudiaron el cultivo de condrocitos en una matriz de polímero encapsulado en gel de óxido de polietileno que permite el transporte de un gran número de células por inyección. Seis semanas después de la inyección en el tejido subcutáneo de ratones atímicos, se formó un nuevo cartílago, que se caracterizó morfológicamente por opalescencia blanca similar a la del cartílago hialino. Los datos de estudios histológicos y bioquímicos indicaron la presencia de condrocitos que proliferan activamente, que producen ECM.

Explicación

El examen del tejido cartilaginoso se usa para estudiar los procesos de ana y catabolismo en él, homeostasis, reabsorción y reparación. Los condrocitos en los explantes de tejido cartilaginoso respaldan el fenotipo y la composición normales de la MEC, similares a los del cartílago articular in vivo. Después de 5 días de cultivo en presencia de suero, se logra un nivel constante de síntesis y degradación natural. La reabsorción puede acelerar el cultivo de tejidos y en el cultivo principal con la adición de suero usando un número de agentes, por ejemplo, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivados del ácido retinoico o radicales de oxígeno activos. Para estudiar la reparación del cartílago, su daño es inducido por mediadores solubles de la inflamación (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) o la ruptura física de la matriz.

El método de cultivos organotípicos es un modelo para estudiar los efectos in vitro de factores externos aislados sobre condrocitos y la matriz circundante. In vivo, los condrocitos rara vez se localizan en la MEC y no se contactan entre sí. El cultivo del cartílago articular explante conserva esta organización estructural, así como las interacciones particulares entre los condrocitos y su entorno extracelular circundante. Este modelo también se usa para estudiar el efecto del estrés mecánico, los agentes farmacológicos, los factores de crecimiento, las citocinas y las hormonas sobre el metabolismo del cartílago.

Otra ventaja de la explantación de tejido cartilaginoso es la ausencia de daño de los condrocitos mediante enzimas proteolíticas o un factor mecánico, que es inevitable cuando las células se aíslan. Los receptores y otras proteínas de membrana y glicoproteínas están protegidos de factores dañinos.

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Cultura de chondrons

El condrón es una unidad estructural, funcional y metabólica del cartílago articular, que consiste en un condrocito, su matriz pericelular y una cápsula compacta de filamentos, y es responsable de la homeostasis de la matriz. Los condones se extraen mecánicamente del cartílago y se recogen mediante varias homogenizaciones sucesivas a baja velocidad. Aislado de las zonas de diferentes profundidades cartílago hondrony se puede dividir en cuatro categorías: sola hondron, hondrony doble, múltiple (tres o más) hondrony linealmente dispuestos (hondronov columna) congestión hondronov.

Por lo general, los condones únicos se encuentran en las capas medias del cartílago intacto, apareados: en el borde de las capas media y profunda, los condones múltiples ubicados linealmente son típicos de las capas profundas del cartílago intacto. Finalmente, los grupos de condones consisten en grupos aleatoriamente organizados de condones individuales y emparejados que retienen el estado agregado después de la homogeneización. Las acumulaciones de condones son fragmentos grandes de cartílago, que generalmente contienen varios condones y fibrillas de colágeno ubicadas radialmente, es decir, una organización típica característica de las capas profundas de la matriz. Los condones se inmovilizan en una agarosa transparente, lo que permite estudiar su estructura, composición molecular y actividad metabólica. Sistema Hondron - agarosa considerado como un modelo micro de cartílago, que es diferente del sistema tradicional de condrocito - agarosa que conserva el microambiente natural, no hay necesidad de llevar a cabo su síntesis y ensamblaje. El cultivo de condones es un modelo para estudiar las interacciones de las células y la matriz en el cartílago articular en condiciones normales y patológicas.

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Cultura de condrocitos inmortales

Para crear líneas celulares permanentes, se usan virus que contienen ADN recombinante o oncógeno que pueden hacer que la célula sea "inmortal". Los condrocitos inmortales tienen la capacidad de proliferación sin fin, manteniendo un fenotipo estable. F. Maleína-Gerin et al (1995) mostró que el oncogén es la proliferación inducida por SV40T de los condrocitos de ratón que de este modo continúan para expresar de forma estable el colágenos II, IX y XI tipos, así como proteína de unión conjunta y agrecano. Sin embargo, tal línea celular adquiere la capacidad de sintetizar colágeno de tipo I cuando se cultiva en un cultivo monocapa o en un gel de agarosa.

W. Horton y sus coautores (1988) describieron una línea de células inmortales con un bajo nivel de expresión de ARNm de colágeno tipo II. Estas células se obtuvieron transformándolas con un retrovirus de ratón que contiene I-myc- y y-ra-oncogenes. Este tipo de células es un modelo único para estudiar las interacciones de la matriz articular en ausencia de colágeno tipo II, así como la regulación de la síntesis del colágeno tipo II.

El cultivo de condropitos con genes mutados o delecionados es un modelo conveniente para estudiar su función fisiológica. Este modelo es especialmente adecuado para estudiar el papel de moléculas específicas en las organizaciones de la matriz de cartílago o el estudio de los efectos de diversos factores de regulación en el metabolismo del cartílago. Condrocitos de genes remoto sintetizado colágeno tipo fibrillas de colágeno IX más amplia de lo normal, lo que indica que el colágeno tipo IX regula el diámetro de las fibrillas. Como he señalado en el capítulo 1, el colágeno recién encontrado mutación del gen COLAI tipo de codificación II en familias con osteoartritis primaria generalizada. Para estudiar el efecto del mutante de colágeno de tipo II en la matriz articular R. Dharmrvaram et al (1997) realizado de transfección ( "contaminación" un ácido nucleico extraño) defectuoso COL ₂ AI (arginina en la posición 519 se sustituye por cisteína) en condrocitos fetales humanos in vitro.

Sistema de coculturas. En la articulación, el cartílago interactúa con las células de otros tipos que se encuentran en la membrana sinovial, el líquido sinovial, los ligamentos y el hueso subcondral. El metabolismo de los condrocitos puede verse influido por diversos factores solubles sintetizados por estas células. Entonces, el cartílago articular de la artritis es destruido por las enzimas proteolíticas y los radicales libres, que son producidos por las células sinoviales. Por lo tanto, se han desarrollado modelos para estudiar interacciones complejas entre el cartílago y los tejidos circundantes, que se denominan cocultivo.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) fueron los condrocitos de conejo cultivadas y los osteoblastos en el sistema de cocultivo (COSTAR), en el que las células se separaron membrana microporosa (0,4 micras) permite el intercambio entre los dos tipos de células sin ningún contacto directo. Este estudio demostró la capacidad de los osteoblastos para estimular el crecimiento de condrocitos a través de mediadores solubles.

A.M. Malfait y coautores (1994) investigaron la relación entre monocitos de sangre periférica y condrocitos. Este modelo es conveniente para estudiar los procesos mediados por citocinas, en artropatías inflamatorias (artritis reumatoide, espondilitis seronegativa, etc.). Los autores del modelo separaron las células mediante una membrana de unión a proteínas con poros de 0,4 μm de diámetro. El estudio encontró que los monocitos estimulados por lipopolisacáridos elaboraron iFNO IL-1-a, que inhibe la síntesis de condrocitos aggrecan y contribuyó a la degradación de los agregados de agrecano ya sintetizados.

K. Tada et al (1994) creado un modelo de cocultivo en la que se pusieron en la cámara interior células endoteliales en colágeno (de tipo I) gel de la cámara exterior separada de ella por condrocitos colocados en un filtro con un tamaño de poro de 0,4 micras. En un estado de completo aislamiento de la cámara externa, las células endoteliales humanas formaron tubos en un gel de colágeno en presencia de EGF o TGF-a. Con el cultivo simultáneo de ambos tipos de células TGF, se inhibió la formación dependiente de los tubos por las células endoteliales. La inhibición de los condrocitos de este proceso fue parcialmente eliminada por los anticuerpos anti-TGF-beta. Se puede suponer que el TGF-beta producido por los condrocitos deprime la vascularización del propio cartílago.

S. Groot y sus coautores (1994) cultivaron simultáneamente condrocitos de las zonas hipertróficas y proliferativas del hueso de un ratón fetal de 16 días con trozos de tejido cerebral. Después de 4 días de cultivo, se observó la transdiferenciación de condrocitos en los osteoblastos y el inicio de la formación de osteoides. Después de 11 días de cultivo, una porción del cartílago fue reemplazada por tejido óseo y la matriz ósea estaba parcialmente calcificada. Algunos neuropéptidos y neurotransmisores producidos por el tejido cerebral afectan el metabolismo de los osteoblastos o tienen receptores en ellos. Entre ellos, se pueden aislar la norepinefrina, el péptido intestinal vasoactivo, el péptido asociado con el gen de la calcitonina, la sustancia P y la somatostatina. Cultivados con condrocitos, pedazos de tejido cerebral pueden producir algunos de estos factores, que pueden inducir el proceso de transdiferenciación de condrocitos en osteoblastos.

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La influencia de factores externos en el cultivo de condrocitos

El efecto de la tensión de oxígeno sobre el metabolismo de los condrocitos

En la mayoría de los casos, los cultivos de condrocitos se desarrollan en condiciones de tensión atmosférica de oxígeno. Sin embargo, es bien sabido que los condrocitos in vivo existen bajo condiciones hipóxicas y la tensión de oxígeno varía con diferentes condiciones patológicas. Durante el proceso de maduración, se observan cambios significativos en el suministro de sangre de las epífisis. Dado que la vascularización varía en diferentes áreas de la placa de crecimiento, la tensión de oxígeno en ellos también varía. C. Brighton y R. Heppenstall (1971) demostraron que en la placa de la tibia en conejos, la tensión de oxígeno en la zona hipertrófica es menor que en el cartílago circundante. Las mediciones de algunos parámetros metabólicos han demostrado que los condrocitos son capaces de reaccionar rápidamente a los cambios locales en la concentración de oxígeno. En primer lugar, con baja tensión de oxígeno, su consumo de condrocitos disminuye. Con una disminución en la tensión de oxígeno de 21 a 0.04%, la utilización de glucosa aumenta, la actividad de la enzima glucólisis y la síntesis de ácido láctico aumentan. Incluso con una baja tensión de oxígeno, la cantidad absoluta de ATP, ADP y AMP permanece estable. Estos datos indican la direccionalidad del metabolismo de los condrocitos para maximizar la conservación de la energía. Sin embargo, la actividad sintética, y por lo tanto los procesos de reparación, cambian bajo condiciones de hipoxia.

La alta tensión de oxígeno también afecta el metabolismo de los condrocitos, causando una disminución en la síntesis de proteoglicanos y ADN, la degradación de la matriz del cartílago. Estos efectos, por regla general, van acompañados de la producción de radicales libres de oxígeno.

Influencia de la concentración de iones y la presión osmótica del ambiente sobre la función de los condrocitos

En el cartílago nativo, la concentración de iones difiere significativamente de la de otros tejidos: el contenido de sodio en el medio extracelular es de 250-350 mmol, y su osmolaridad es de 350-450 mosmol. Cuando el aislamiento de condrocitos a partir de un VCR y la incubación en un medio estándar (DMEM (medio esencial mínimo de Dulbecco - Dulbecco medio esencial mínimo) osmolaridad - 250-280,7 mOsm) cambia bruscamente el medio ambiente circundante de la célula. Además, la concentración de calcio y potasio en medios estándar es mucho menor que en el tejido nativo, y la concentración de aniones es mucho mayor.

La adición de sacarosa al medio conduce a un aumento en su osmolaridad e induce un aumento intracelular transitorio en la concentración de aniones de H ⁺ y calcio en el citosol. Dichos cambios intracelulares pueden influir en los procesos de diferenciación de condrocitos y su actividad metabólica. J. Urban et al (1993) encontraron que la inclusión de ³⁵ 8-sulfato y ³ condrocitos aislados H-prolina incubadas en medio DMEM estándar durante 2-4 horas, era sólo el 10% de que en el tejido nativo. La intensidad de la síntesis alcanzó un máximo con la osmolaridad del medio extracelular de 350-400 mosmol tanto en los condrocitos recién aislados como en los explantes del tejido cartilaginoso. Además, el volumen de condrocitos aumentó en 30-40% después de colocar células aisladas en un medio DMEM estándar de dicha osmolaridad. Sin embargo, cuando los condrocitos cultivados bajo osmolaridad no fisiológico durante 12-16 horas, las células adaptadas al nuevo entorno mediante la reducción de la intensidad de cizallamiento es proporcional osmolaridad biosíntesis del medio extracelular.

P. Borgetti et al (1995) investigaron el efecto de la osmolaridad del medio extracelular en el crecimiento, la morfología y la biosíntesis de condrocitos porcinos. Los autores demostraron características bioquímicas y morfológicas similares de condrocitos cultivados en medios con osmolaridad de 0.28 y 0.38 mosmol. Cuando se observó 0,48 mOsm osmolaridad del medio durante las primeras 4-6 horas de cultivo disminución en la proliferación celular y la síntesis de proteínas, pero posteriormente producido restaurar estos parámetros que eventualmente llegaron a los valores de control. Cuando el cultivo de condrocitos en un medio con células de osmolaridad 0,58 mOsm perder su capacidad para soportar los procesos proliferativos de intensidad fisiológica y después de 6 días el número de condrocitos se reduce significativamente. Con la osmolaridad del medio, 0,58 mosmol, se observa una inhibición profunda de la síntesis de proteínas. Además, cuando se cultivan en medios con una osmolaridad mOsm 0,28-0,38 condrocitos conservan fenotipo fisiológico a una osmolaridad superior (mOsm 0,48-0,58) cambios significativos en la morfología celular, como la pérdida manifestada fenotipo característico de condrocitos conversión en células similares a fibroblastos, así como en la pérdida de células, la capacidad de ensamblar proteoglicanos de matriz. Los resultados de este estudio indican la capacidad de los condrocitos para responder a oscilaciones de osmolalidad limitadas en el entorno extracelular.

El cambio en la concentración de otros iones también puede afectar los procesos de biosíntesis en condrocitos. Por lo tanto, el grado de inclusión de ³⁵ S (sulfato) aumenta a la mitad con un aumento en la concentración de iones de potasio de 5 mmol (concentración en un medio estándar DM DM) a 10 mmol (concentración en VKM in vivo). La concentración de calcio por debajo de 0.5 mmol contribuyó a la producción de colágeno por condrocitos de toro maduros, mientras que una concentración de 1-2 mmol (que corresponde a la concentración en el medio DM DM estándar) causó una reducción significativa en la síntesis de colágeno. Se observó un aumento moderado en la biosíntesis a altos niveles de calcio (2-10 mmol). Varios cationes participan en la unión de condrocitos a las proteínas VKM. Por lo tanto, los iones de magnesio y manganeso proporcionan adhesión a fibronectina y colágeno tipo II, mientras que los iones calcio no participan en la unión de condrocitos a las proteínas. Por lo tanto, los resultados de los estudios descritos indican la influencia de los cambios en los iones extracelulares de potasio, sodio, calcio y osmolaridad del medio sobre la función biosintética de los condrocitos incubados en medios estándar.

La influencia del estrés mecánico sobre el metabolismo de los condrocitos

La inmovilización de la articulación causa una atrofia reversible del cartílago, lo que indica la necesidad de estímulos mecánicos para el curso normal de los procesos metabólicos en la MEC. En la mayoría de los casos, los modelos de cultivo celular utilizados existen en condiciones de presión atmosférica normal. M. Wright y sus coautores (1996) demostraron que el entorno mecánico afecta el metabolismo de los condrocitos, la respuesta de las células depende de la intensidad y la frecuencia de la carga de compresión. Los experimentos con carga en explantes de cartílago articular intacto in vitro demostraron una disminución en la síntesis de proteínas y proteoglicanos bajo la acción de una carga estática, mientras que la carga dinámica estimula estos procesos. Los mecanismos exactos para realizar el efecto del estrés mecánico en el cartílago son complejos y probablemente estén relacionados con la deformación celular, la presión hidrostática, la presión osmótica, el potencial eléctrico y los receptores celulares de superficie de las moléculas de la matriz. Para estudiar el efecto de cada uno de estos parámetros, es necesario crear un sistema en el que un parámetro se pueda variar independientemente. Por ejemplo, un cultivo de explantes no es adecuado para estudiar la deformación celular, pero se puede usar para estudiar el efecto general de la presión sobre la actividad metabólica de los condrocitos. La compresión del cartílago conduce a la celda de deformación, y también acompañada por la aparición de gradiente de presión hidrostática, potencial eléctrico, y el cambio de flujo de fluido fisicoquímica factores tales como el contenido de agua en la matriz, la densidad de la carga eléctrica, el nivel de la presión osmótica. La deformación celular se puede estudiar usando condrocitos aislados sumergidos en una agarosa o gel de colágeno.

Se han desarrollado varios sistemas para estudiar el efecto de la estimulación mecánica en el cultivo de condrocitos. Algunos investigadores usan sistemas para este propósito en los que la presión se aplica al cultivo celular a través de la fase gaseosa. Por ejemplo, JP Veldhuijzen et al (1979), utilizando una presión superior a la atmosférica de 13 kPa a una baja frecuencia (0,3 Hz) durante 15 minutos, observó un aumento en la síntesis de AMPc y proteoglicanos y la reducción de la síntesis de ADN. R. Smith et al (1996) demostraron que la exposición intermitente de cultivos primarios de condrocitos toro presión hidrostática (10 MPa) a 1 Hz durante 4 horas causado el aumento de la síntesis de agrecano y colágeno de tipo II, mientras que la presión constante no tuvo efecto sobre estos procesos. El uso de un sistema similar M. Wright et al (1996) informó que la presión cíclica en el cultivo de células está asociada con la hiperpolarización de la membrana celular de los condrocitos y la activación de Ca ^{2 +} canales de potasio dependientes. Por lo tanto, los efectos de la presión cíclica están mediados por canales de iones, activados por estiramiento, en la membrana de condrocitos. La respuesta de los condrocitos a la presión hidrostática depende de las condiciones del cultivo celular y la frecuencia de la carga aplicada. Por lo tanto, la presión hidrostática cíclico (5 MPa) reduce la incorporación de sulfato en monocapa de condrocitos a una frecuencia de 0,05, 0,25 y 0,5 Hz, mientras que para frecuencias superiores a 0,5 Hz sulfato de inclusión en incrementos de explantes de cartílago.

M. Bushmann y otros (1992) informaron que los condrocitos en un gel de agarosa alteran la biosíntesis en respuesta a una carga mecánica estática y dinámica de la misma manera que un órgano intacto cultivado. Los autores encontraron que la carga mecánica genera un estímulo hiperosmótico seguido de una disminución del pH en los condrocitos.

El efecto del estiramiento mecánico se puede estudiar en un cultivo de células inmersas en un gel. La fuerza de estiramiento se puede crear usando una aspiradora controlada por computadora. Cuando el sistema está en un cierto grado de vacío, la parte inferior de una placa de Petri con un cultivo de células se prolonga por una cantidad conocida, una deformación máxima en los bordes de la parte inferior taza y mínimo en el centro. El estiramiento se transmite y se cultiva en una placa de Petri de condrocitos. Con la ayuda de este método, Holm-vall y sus coautores (1995) han demostrado que la expresión de ARNm de α2 _- integrina aumenta en células de condrosarcoma en gel de colágeno (tipo II) cultivadas . Un ₂ p _r integrina es capaz de unirse a colágeno de tipo II. Se considera como un mecanoreceptor, ya que interactúa con las proteínas de unión a la actina, conectando así la ECM y el citoesqueleto.

Efecto del pH sobre el metabolismo de los condrocitos

El pH del fluido intersticial de la MEC del tejido cartilaginoso es más ácido que en otros tejidos. A. Maroudas (1980) determinó el pH del cartílago articular en 6.9. W. Diamant y sus coautores (1966) encontraron un pH de 5.5 en condiciones patológicas. Se sabe que los condrocitos viven a PO2 baja, lo que indica el importante papel de la glucólisis (95% del metabolismo total de la glucosa) en el metabolismo de estas células; la glucólisis va acompañada de la producción de una gran cantidad de ácido láctico.

Además de la acidificación del medio ambiente por los productos de la glucólisis, los propios componentes de la matriz son de gran importancia. Un gran número de carga negativa fija en los proteoglicanos extracelulares modifica la composición iónica: hay una alta concentración de cationes libres (por ejemplo, H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) y baja concentración de aniones (por ejemplo, O2, NPHS). Además, bajo la influencia de una carga mecánica, el agua se expulsa del ECM, lo que conduce a un aumento en la concentración de cargas negativas fijas y la atracción de más cationes a la matriz. Esto va acompañado de una disminución en el pH del medio extracelular, que afecta el pH intracelular, modificando así el metabolismo de los condrocitos. R. Wilkin y A. Hall (1995) estudiaron el efecto del pH del medio extracelular e intracelular en la biosíntesis de la matriz por condrocitos de toro aislados. Observaron una modificación doble de la síntesis de la matriz con una disminución en el pH. Una ligera disminución en el pH (7,4 35 S0 ₄ y ³ H-prolina en condrocitos, mientras que la acidificación más profunda (pH <7,1) inhibe la síntesis en un 75% en comparación con control. Crear el mismo pH bajo (6.65) con iones de amonio causó una disminución en la síntesis de la matriz de solo el 20%. Los resultados obtenidos indican que la modificación del pH del medio de síntesis de la matriz extracelular no puede explicarse solo por cambios en el pH del medio intracelular. Además, los condrocitos poseen la capacidad de regular el pH intracelular por Na ⁺, H ⁺ intercambiador, Ca ⁺ -dependiente C1 ^_ -NSOZ -TRANSPORTES y H ⁺ / ATPasa.

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Efecto de la composición del medio de cultivo sobre el metabolismo de los condrocitos

El medio para cultivar los condrocitos debe corresponder a las condiciones experimentales. En los últimos años, el suero de ternera se ha utilizado para optimizar las condiciones de cultivo. Sin embargo, cuando se usa suero, se deben considerar una serie de puntos importantes:

• crecimiento externo de células de la periferia del tejido en cultivos de órganos,
• la variabilidad de la composición de sueros de varias series,
• presencia de componentes desconocidos en ellos,
• mayor riesgo de interferencia, artefactos en el estudio de la influencia de diversos factores biológicos en la actividad metabólica de las células.

Un ejemplo de esto último es el estudio del efecto del EGF en condrocitos de cartílago en ratas. EGF estimula la incorporación de ³ H-timidina y aumentar el contenido de ADN en el cultivo. Este efecto fue más pronunciado a bajas concentraciones séricas (<1%), pero a altas concentraciones (> 7,5%) el efecto desapareció.

Es bien sabido que los niveles de síntesis y degradación en DMEM enriquecido con suero de ternera aumentan significativamente en comparación con las condiciones in vivo. Las diferencias entre el metabolismo in vivo e in vitro pueden ser causadas por diferencias entre el fluido sinovial y el entorno en el que se cultivan las células. D. Lee et al (1997) fueron los condrocitos cultivados toros jóvenes de agarosa utilizando un medio nutriente que contiene DMEM, enriquecido con suero de ternera 20% y un gran número de fluido sinovial normal alogénico. La presencia de líquido sinovial en el medio indujo un aumento en el número de proteoglicanos, hasta el 80% de la cantidad total de líquido sinovial. Los resultados obtenidos indican que el líquido sinovial en cultivo induce una tasa metabólica similar a la in vivo, con un alto nivel de síntesis de glicosaminoglicanos y un bajo nivel de división celular.

G. Verbruggen et al (1995) mostró que la síntesis de ³⁵ S-arrpeKaHa condrocitos humanos cultivados en agarosa en DMEM sin suero fue del 20-30% del nivel de la síntesis observado en DMEM, suplementado con suero de ternera al 10%. Los autores determinar la extensión a la que el IGF-1, IGF-2, TGF-P o reducidas aggrecan producción de insulina en medio sin suero. Los autores concluyeron que el 100 ng ml de insulina / IGF-1 o IGF-2 síntesis en parte reducida de aggrecan a 39-53% de los niveles de control. Con una combinación de estos factores, no se han identificado fenómenos sinérgicos o acumulativos. Al mismo tiempo, 10 ng / ml de TGF-P en presencia de 100 ng de insulina / ml estimularon la síntesis de agrecano a 90% o más del nivel de referencia. Finalmente, la transferrina sérica, sola o en combinación con insulina, no afectó la síntesis de agrecano. Cuando el suero de ternera fue reemplazado con albúmina de suero bovino, el contenido agregado de agrecano se redujo significativamente. El enriquecimiento del medio para cultivo de insulina, IGF o TGF-P restauró parcialmente la capacidad de las células para producir agregados de agrecano. En este caso, IGF-1 e insulina pueden mantener la homeostasis en cultivos celulares. Después de 40 días de cultivo en medio suplementado con 10-20 ng / ml de IGF-1, la síntesis de proteoglicanos se mantuvo en el mismo nivel o incluso superior en comparación con medio que contiene suero de ternera 20%. Procesos catabólicos procedió lentamente en medio suplementado con IGF-1 que en el medio suplementado con solución de albúmina al 0,1%, pero algo más rápido en medio suplementado con 20% de suero. En cultivos de larga vida, 20 ng / ml de IGF-1 mantienen un estado estable de las células.

D. Lee et al (1993) comparó el efecto de la composición del medio de cultivo (DMEM, DMEM + 20% de suero de ternera, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) sobre la síntesis de DNA en un cultivo de explante de cartílago, cultivo en monocapa y en suspensión en agarosa . Cuando se cultivaron en agarosa en presencia de suero, los autores observaron una tendencia a agrupar los condrocitos en grandes racimos. Las células cultivadas sin suero o con IGF-1 se almacenaron en una agarosa de forma redonda, ensambladas en pequeños grupos, pero no formaron grandes agregados. En la monocapa, la síntesis de ADN fue significativamente mayor en los medios que contienen suero que en el medio enriquecido con IGF-1; La síntesis de ADN en este último fue mucho mayor que en el entorno no enriquecido. Cuando el cultivo de condrocitos en suspensión en agarosa en medio no concentrado y en un medio con IGF-1, no hay diferencia en la síntesis de ADN. Al mismo tiempo, la suspensión de cultivo de condrocitos en agarosa en medio suplementado con suero, fue acompañado por un aumento de la incorporación de radionucleótidos ³ H-timidina en comparación con otros entornos.

La vitamina C es necesaria para la activación de las enzimas involucradas en la formación de una estructura en espiral estable de fibrillas de colágeno. Los condrocitos, deficientes con respecto al ácido ascórbico, sintetizan precursores no hélicos subhidroxilados de colágeno, que se secretan lentamente. La introducción de ácido ascórbico (50 μg / ml) provoca la hidroxilación de los tipos de colágeno II y IX y su secreción en cantidades normales. La adición de vitamina C no afectó el nivel de síntesis de proteoglicanos. En consecuencia, la secreción de colágeno se regula independientemente de la secreción de proteoglicanos.

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