Corynebacterium

La difteria es una enfermedad infecciosa aguda que afecta principalmente a niños y se manifiesta por una intoxicación profunda del organismo con la toxina diftérica y una inflamación fibrinosa característica en el lugar donde se localiza el patógeno. El nombre de la enfermedad proviene del griego diphthera (piel, película), ya que se forma una película densa de color blanco grisáceo en el lugar de reproducción del patógeno.

El agente causal de la difteria, Corynebacterium diphtheriae, fue descubierto por primera vez en 1883 por E. Klebs en secciones de película, y fue obtenido en cultivo puro en 1884 por F. Leffler. En 1888, E. Roux y A. Yersin descubrieron su capacidad para producir una exotoxina, la cual desempeña un papel fundamental en la etiología y patogénesis de la difteria. La producción de suero antitóxico por E. Behring en 1892 y su uso desde 1894 para el tratamiento de la difteria permitieron reducir significativamente la mortalidad. El éxito en la lucha contra esta enfermedad comenzó después de 1923, gracias al desarrollo de un método para la obtención de la anatoxina diftérica por G. Raion.

El agente causal de la difteria pertenece al género Corynebacterium (clase Actinobacteria). Morfológicamente, se caracteriza por tener células en forma de maza y engrosadas en los extremos (del griego coryne, maza), ramificarse, especialmente en cultivos antiguos, y contener inclusiones granulares.

El género Corynebacterium incluye un gran número de especies, que se dividen en tres grupos.

• Las corinebacterias son parásitos de los seres humanos y de los animales y son patógenas para ellos.
• Corinebacterias patógenas para las plantas.
• Corinebacterias no patógenas. Muchas especies de corinebacterias habitan normalmente en la piel, las mucosas de la faringe, la nasofaringe, los ojos, el tracto respiratorio, la uretra y los genitales.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Morfología de las corinebacterias

C. diphtheriae son bacilos rectos o ligeramente curvados, inmóviles, de 1,0-8,0 μm de largo y 0,3-0,8 μm de diámetro; no forman esporas ni cápsulas. Suelen presentar hinchazones en uno o ambos extremos y suelen contener gránulos metacromáticos, granos de volutina (polimetafosfatos), que adquieren un color púrpura azulado al teñirse con azul de metileno. Se ha propuesto un método especial de tinción de Neisser para su detección. En este caso, los bacilos se tiñen de amarillo pajizo y los granos de volutina son marrón oscuro, y suelen localizarse en los polos. Corynebacterium diphtheriae se tiñe bien con colorantes de anilina y es grampositiva, pero en cultivos antiguos suele decolorarse y presenta una tinción negativa según Gram. Se caracteriza por un polimorfismo pronunciado, especialmente en cultivos antiguos y bajo la influencia de antibióticos. El contenido de G + C en el ADN es de aproximadamente el 60 % molar.

Propiedades bioquímicas de las corinebacterias

El bacilo de la difteria es un anaerobio o anaerobio facultativo, la temperatura óptima para el crecimiento es de 35-37 °C (los límites de crecimiento son de 15-40 °C), el pH óptimo es de 7,6-7,8. No es muy exigente con los medios nutritivos, pero crece mejor en medios que contienen suero o sangre. Los medios de Roux o Loeffler con suero cuajado son selectivos para las bacterias de la difteria; el crecimiento en ellos aparece después de 8-12 horas en forma de colonias convexas del tamaño de una cabeza de alfiler, de color blanco grisáceo o crema amarillento. Su superficie es lisa o ligeramente granular, en la periferia las colonias son algo más transparentes que en el centro. Las colonias no se fusionan, como resultado de lo cual el cultivo adquiere la apariencia de cuero de piel de tiburón. En el caldo, el crecimiento se manifiesta como una turbidez uniforme, o bien el caldo permanece transparente y se forma una película delicada en su superficie, que gradualmente se espesa, se desmorona y se deposita en copos hasta el fondo.

Una característica de las bacterias de la difteria es su buen crecimiento en medios de cultivo con sangre y suero que contienen concentraciones de telurito de potasio tales que inhiben el crecimiento de otros tipos de bacterias. Esto se debe a que C. diphtheriae reduce el telurito de potasio a telurio metálico, el cual, al depositarse en las células microbianas, confiere a las colonias un color gris oscuro o negro característico. El uso de estos medios aumenta el porcentaje de siembra de bacterias de la difteria.

Corynebacterium diphtheriae fermenta glucosa, maltosa y galactosa, formando ácido sin gas, pero no fermenta (generalmente) sacarosa, posee cistinasa, carece de ureasa y no forma indol. Estas características la diferencian de las bacterias corineformes (difteroides) que se encuentran con mayor frecuencia en la mucosa ocular (Corynebacterium xerosus) y nasofaringe (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum), así como de otros difteroides.

En la naturaleza, existen tres variantes principales (biotipos) del bacilo de la difteria: gravis, intermedins y mitis. Se diferencian en sus propiedades morfológicas, culturales, bioquímicas y de otro tipo.

La división de las bacterias de la difteria en biotipos se realizó teniendo en cuenta las formas de difteria en pacientes con mayor frecuencia de aislamiento. El tipo gravis se aísla con mayor frecuencia en pacientes con difteria grave y causa brotes grupales. El tipo mitis causa casos más leves y esporádicos de la enfermedad, y el tipo intermedio ocupa una posición intermedia entre ambos. Corynebacterium belfanti, previamente atribuido al biotipo mitis, se aísla como un cuarto biotipo independiente. Su principal diferencia con los biotipos gravis y mitis es su capacidad para reducir los nitratos a nitritos. Las cepas de Corynebacterium belfanti presentan marcadas propiedades adhesivas, y se encuentran entre ellas variantes tanto toxigénicas como no toxigénicas.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Estructura antigénica de las corinebacterias

Corynebacterium es muy heterogéneo y presenta una estructura en mosaico. Se han encontrado varias docenas de antígenos somáticos en los tres tipos de patógenos de la difteria, según los cuales se dividen en serotipos. En Rusia, se ha adoptado una clasificación serológica que distingue 11 serotipos de bacterias de la difteria, de los cuales 7 son principales (1-7) y 4 son serotipos adicionales, poco frecuentes (8-11). Seis serotipos (1, 2, 3, 4, 5, 7) pertenecen al tipo gravis, y cinco (6, 8, 9, 10, 11) pertenecen al tipo mitis. Una desventaja del método de serotipificación es que muchas cepas, especialmente las no toxigénicas, presentan aglutinación espontánea o poliaglutinabilidad.

[ 11 ]

Tipificación de fagos de Corynebacterium diphtheriae

Se han propuesto diversos esquemas de fagotipificación para diferenciar las bacterias de la difteria. Según el esquema de M. D. Krylova, utilizando un conjunto de 9 fagos (A, B, C, D, F, G, H, I, K), es posible tipificar la mayoría de las cepas toxigénicas y no toxigénicas del tipo gravis. Considerando la sensibilidad a los fagos especificados, así como las propiedades antigénicas y culturales, y la capacidad de sintetizar coricinas (proteínas bactericidas), M. D. Krylova identificó tres grupos independientes de corinebacterias del tipo gravis (I-III). Cada uno de ellos contiene subgrupos de patógenos de la difteria toxigénicos y sus análogos no toxigénicos.

Resistencia a Corynebacterium

Corynebacterium diphtheriae presenta una alta resistencia a las bajas temperaturas, pero muere rápidamente a altas temperaturas: a 60 °C, en 15-20 minutos, y en ebullición, en 2-3 minutos. Todos los desinfectantes (lysol, fenol, cloramina, etc.) en la concentración habitual la destruyen en 5-10 minutos. Sin embargo, el patógeno de la difteria tolera bien la desecación y puede permanecer viable durante mucho tiempo en moco, saliva y partículas de polvo secas. En un aerosol fino, la bacteria de la difteria permanece viable durante 24-48 horas.

Factores de patogenicidad de las corinebacterias

La patogenicidad de Corynebacterium diphtheriae está determinada por la presencia de una serie de factores.

Factores de adhesión, colonización e invasión

No se han identificado las estructuras responsables de la adhesión, pero sin ellas, el bacilo de la difteria no podría colonizar las células. Su función la desempeñan algunos componentes de la pared celular del patógeno. Las propiedades invasivas del patógeno se asocian con la hialuronidasa, la neuraminidasa y la proteasa.

Un glicolípido tóxico presente en la pared celular del patógeno. Es un 6,6'-diéster de trehalosa que contiene ácido corinemicólico (C₃₂H₆₃O₃) y ácido corinemicólico (C₃₂H₆₃O₃) en proporciones equimolares (trehalosa-6,6'-dicorinemicolato). Este glicolípido tiene un efecto destructivo sobre las células tisulares en el sitio de reproducción del patógeno.

Exotoxina, que determina la patogenicidad del patógeno y la naturaleza de la patogénesis de la enfermedad. Las variantes no toxigénicas de C. diphtheriae no causan difteria.

La exotoxina se sintetiza como un precursor inactivo: una cadena polipeptídica única con un peso molecular de 61 kD. Es activada por la propia proteasa bacteriana, que divide el polipéptido en dos péptidos unidos por enlaces disulfuro: A (peso molecular 21 kD) y B (peso molecular 39 kD). El péptido B realiza una función aceptora: reconoce el receptor, se une a él y forma un canal intramembrana a través del cual el péptido A penetra en la célula y realiza la actividad biológica de la toxina. El péptido A es una enzima ADP-ribosiltransferasa, que asegura la transferencia de adenosina difosfato ribosa desde NAD a uno de los residuos de aminoácidos (histidina) del factor de elongación proteico EF-2. Como resultado de la modificación, EF-2 pierde su actividad, lo que conduce a la supresión de la síntesis proteica por los ribosomas en la etapa de translocación. La toxina es sintetizada únicamente por aquellas C. diphtheriae que portan los genes del profago de conversión moderado en su cromosoma. El operón que codifica la síntesis de la toxina es monocistrónico, consta de 1.900 pares de nucleótidos y tiene un promotor toxP y 3 regiones: toxS, toxA y toxB. La región toxS codifica 25 residuos de aminoácidos del péptido señal (asegura la liberación de la toxina a través de la membrana hacia el espacio periplásmico de la célula bacteriana), toxA - 193 residuos de aminoácidos del péptido A, y toxB - 342 residuos de aminoácidos del péptido B de la toxina. La pérdida del profago por la célula o mutaciones en el operón tox hacen que la célula sea ligeramente toxigénica. Por el contrario, la lisogenización de C. diphtheriae no toxigénicas por el fago de conversión las convierte en bacterias toxigénicas. Esto se ha demostrado inequívocamente: la toxigenicidad de las bacterias de la difteria depende de su lisogenización por parte de los corinefágicos que convierten toxinas. Los corinefágicos se integran en el cromosoma de las corinebacterias mediante el mecanismo de recombinación sitio-específica, y las cepas de bacterias de la difteria pueden contener dos sitios de recombinación (attB) en sus cromosomas, y los corinefágicos se integran en cada uno de ellos con la misma frecuencia.

El análisis genético de varias cepas no toxigénicas de bacterias de la difteria, realizado mediante sondas de ADN marcadas con fragmentos del operón tox del corinefago, mostró que sus cromosomas contienen secuencias de ADN homólogas al operón tox del corinefago, pero codifican polipéptidos inactivos o se encuentran en estado "silencioso", es decir, inactivos. En este sentido, surge una pregunta epidemiológica crucial: ¿pueden las bacterias no toxigénicas de la difteria transformarse en toxigénicas en condiciones naturales (en el cuerpo humano), de forma similar a lo que ocurre in vitro? La posibilidad de dicha transformación de cultivos no toxigénicos de corinebacterias en toxigénicos mediante fagoconversión se demostró en experimentos con cobayas, embriones de pollo y ratones blancos. Sin embargo, aún no se ha determinado si esto ocurre durante el proceso epidémico natural (y, de ser así, con qué frecuencia).

Debido a que la toxina de la difteria en el cuerpo de los pacientes tiene un efecto selectivo y específico sobre ciertos sistemas (el sistema simpático-suprarrenal, el corazón, los vasos sanguíneos y los nervios periféricos se ven afectados principalmente), es obvio que no solo inhibe la biosíntesis de proteínas en las células, sino que también causa otras alteraciones en su metabolismo.

Los siguientes métodos se pueden utilizar para detectar la toxicidad de la bacteria de la difteria:

• Pruebas biológicas en animales. La infección intradérmica de cobayas con un filtrado de un caldo de cultivo de bacterias diftéricas causa necrosis en el punto de inyección. Una dosis letal mínima de toxina (20-30 ng) mata a una cobaya de 250 g de peso al inyectarse por vía subcutánea entre el cuarto y quinto día. La manifestación más característica de la acción de la toxina es el daño a las glándulas suprarrenales, que presentan un aumento de tamaño y una marcada hiperemia.
• Infección de embriones de pollo. La toxina diftérica causa su muerte.
• Infección de cultivos celulares. La toxina diftérica causa un efecto citopático distintivo.
• Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en fase sólida que utiliza antitoxinas marcadas con peroxidasa.
• Uso de una sonda de ADN para la detección directa del operón tox en el cromosoma de la bacteria de la difteria.

Sin embargo, el método más simple y común para determinar la toxicidad de las bacterias de la difteria es serológico: el método de precipitación en gel. Su esencia es la siguiente. Una tira de papel de filtro estéril que mide 1,5 x 8 cm se humedece con suero antitóxico antidiftérico que contiene 500 AE en 1 ml y se aplica a la superficie del medio nutritivo en una placa de Petri. La placa se seca en un termostato durante 15-20 minutos. Los cultivos de prueba se siembran con placas en ambos lados del papel. Varias cepas se siembran en una placa, una de las cuales, obviamente tóxica, sirve como control. Las placas con los cultivos se incuban a 37 °C, los resultados se tienen en cuenta después de 24-48 horas. Debido a la contradifusión de la antitoxina y la toxina en el gel, se forma una línea de precipitación clara en el sitio de su interacción, que se fusiona con la línea de precipitación de la cepa toxigénica de control. Las bandas de precipitación no específicas (se forman si, además de la antitoxina, hay otros anticuerpos antimicrobianos en pequeñas cantidades en el suero) aparecen tarde, se expresan débilmente y nunca se fusionan con la banda de precipitación de la cepa de control.

Inmunidad postinfecciosa

Rara vez se observan casos recurrentes de la enfermedad, graves, persistentes y prácticamente de por vida (en el 5-7% de quienes la han padecido). La inmunidad es principalmente antitóxica; los anticuerpos antimicrobianos tienen menor importancia.

La prueba de Schick se utilizaba ampliamente para evaluar el nivel de inmunidad antidiftérica. Para ello, se inyectaba intradérmicamente en niños 1/40 de la toxina de cobaya en un volumen de 0,2 ml. En ausencia de inmunidad antitóxica, al cabo de 24-48 horas aparece enrojecimiento e hinchazón de más de 1 cm de diámetro en el lugar de la inyección. Una reacción de Schick positiva indica la ausencia total de antitoxina o que su contenido es inferior a 0,001 EA/ml de sangre. Se observa una reacción de Schick negativa cuando el contenido de antitoxina en sangre es superior a 0,03 EA/ml. Si el contenido de antitoxina es inferior a 0,03 EA/ml pero superior a 0,001 EA/ml, la reacción de Schick puede ser positiva o, en ocasiones, negativa. Además, la propia toxina posee una marcada propiedad alergénica. Por lo tanto, para determinar el nivel de inmunidad antidiftérica (contenido cuantitativo de antitoxina), es mejor utilizar RPGA con un diagnóstico de eritrocitos sensibilizado con toxoide diftérico.

Epidemiología de la difteria

La única fuente de infección es una persona, ya sea enferma, en recuperación o portadora sana de la bacteria. La infección se produce a través de gotitas y polvo en suspensión en el aire, y a través de diversos objetos utilizados por portadores enfermos o sanos: platos, libros, ropa de cama, juguetes, etc. En caso de contaminación de productos alimenticios (leche, cremas, etc.), la infección es posible a través de la ruta alimentaria. La excreción más masiva del patógeno ocurre en la forma aguda de la enfermedad. Sin embargo, las personas con formas latentes y atípicas de la enfermedad son de la mayor importancia epidemiológica, ya que a menudo no son hospitalizadas y no se detectan de inmediato. Un paciente con difteria es infeccioso durante todo el período de la enfermedad y parte del período de recuperación. El período promedio de portación de bacterias en personas en recuperación varía de 2 a 7 semanas, pero puede durar hasta 3 meses.

Los portadores sanos desempeñan un papel especial en la epidemiología de la difteria. En condiciones de morbilidad esporádica, son los principales transmisores de la difteria, contribuyendo a la preservación del patógeno en la naturaleza. La duración media de la portación de las cepas toxigénicas es algo menor (unos dos meses) que la de las no toxigénicas (unos dos a tres meses).

La razón de la formación de una portadora saludable de bacterias diftéricas toxigénicas y no toxigénicas no se ha dilucidado por completo, ya que incluso un alto nivel de inmunidad antitóxica no siempre garantiza la completa eliminación del patógeno en el organismo. Quizás el nivel de inmunidad antibacteriana tenga cierta importancia. La portadora de cepas toxigénicas de bacterias diftéricas tiene una importancia epidemiológica fundamental.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Síntomas de la difteria

Las personas de cualquier edad son susceptibles a la difteria. El patógeno puede penetrar en el cuerpo humano a través de las membranas mucosas de diversos órganos o a través de la piel dañada. Dependiendo de la localización del proceso, se distingue la difteria de la faringe, la nariz, la laringe, el oído, los ojos, los genitales y la piel. Son posibles formas mixtas, por ejemplo, la difteria de la faringe y la piel, etc. El período de incubación es de 2 a 10 días. En la forma clínicamente expresada de la difteria, se desarrolla una inflamación fibrinosa característica de la membrana mucosa en el sitio de localización del patógeno. La toxina producida por el patógeno afecta primero a las células epiteliales y luego a los vasos sanguíneos cercanos, aumentando su permeabilidad. El exudado saliente contiene fibrinógeno, cuya coagulación conduce a la formación de una película de color blanco grisáceo en la superficie de la membrana mucosa, que se fusiona firmemente con el tejido subyacente y, al desprenderse, causa sangrado. La consecuencia del daño a los vasos sanguíneos puede ser el desarrollo de edema local. La difteria faríngea es especialmente peligrosa, ya que puede causar crup diftérico debido al edema de la membrana mucosa de la laringe y las cuerdas vocales, enfermedad por la cual el 50-60% de los niños con difteria solían morir por asfixia. La toxina diftérica, al entrar en la sangre, causa una intoxicación generalizada profunda. Afecta principalmente a los sistemas cardiovascular, simpático-suprarrenal y a los nervios periféricos. Por lo tanto, los síntomas de la difteria consisten en una combinación de signos locales, dependiendo de la ubicación de la puerta de entrada, y síntomas generales causados por la intoxicación con la toxina, que se manifiestan en forma de adinamia, letargo, palidez, presión arterial baja, miocarditis, parálisis de los nervios periféricos y otros trastornos. La difteria en niños vacunados, si se observa, suele cursar de forma leve y sin complicaciones. La tasa de mortalidad en el período anterior al uso de sueroterapia y antibióticos era del 50-60%, ahora es del 3-6%.

Diagnóstico de laboratorio de la difteria

El único método de diagnóstico microbiológico de la difteria es el bacteriológico, con análisis obligatorio de toxicidad del cultivo aislado de corinebacterias. Los estudios bacteriológicos para la difteria se realizan en tres casos:

• para el diagnóstico de la difteria en niños y adultos con procesos inflamatorios agudos en la faringe, nariz y nasofaringe;
• según indicaciones epidemiológicas de las personas que estuvieron en contacto con la fuente del agente patógeno de la difteria;
• personas de nuevo ingreso en orfanatos, guarderías, internados y otras instituciones especiales para niños y adultos, con el fin de identificar entre ellas posibles portadores del bacilo de la difteria.

El material para el estudio es moco de la faringe y la nariz, frotis de las amígdalas u otras membranas mucosas, que son el punto de entrada para el patógeno. La siembra se realiza en medios de suero telurito o sangre y simultáneamente en medios de suero coagulado Roux (suero coagulado de caballo) o Loeffler (3 partes de suero bovino + 1 parte de caldo de azúcar), en los que aparece crecimiento de corinebacterias después de 8-12 horas. El cultivo aislado se identifica por una combinación de propiedades morfológicas, culturales y bioquímicas, utilizando métodos de serotipificación y fagotipificación siempre que sea posible. En todos los casos, es obligatoria una prueba de toxicidad utilizando uno de los métodos anteriores. Las características morfológicas de las corinebacterias se estudian mejor utilizando tres métodos de tinción de una preparación de frotis: Gram, Neisser y azul de metileno (o azul de toluidina).

Tratamiento de la difteria

Un tratamiento específico para la difteria es el uso de suero antitóxico antidiftérico que contenga al menos 2000 UI por ml. El suero se administra por vía intramuscular en dosis de 10 000 a 400 000 UI, según la gravedad de la enfermedad. Un método de tratamiento eficaz es el uso de antibióticos (penicilinas, tetraciclinas, eritromicina, etc.) y sulfonamidas. Para estimular la producción de sus propias antitoxinas, se puede utilizar anatoxina. Para eliminar la carga bacteriana, se deben utilizar antibióticos a los que la cepa de corinebacterias en cuestión sea altamente sensible.

Profilaxis específica de la difteria

El principal método para combatir la difteria es la vacunación masiva planificada de la población. Para ello, se utilizan diversas opciones de vacunación, incluidas las combinadas, es decir, destinadas a la creación simultánea de inmunidad contra varios patógenos. La vacuna más extendida en Rusia es la DPT. Se trata de una suspensión de bacterias de la tos ferina adsorbidas en hidróxido de aluminio, inactivadas con formalina o timerosal (20 mil millones en 1 ml), que contiene toxoide diftérico en una dosis de 30 unidades floculantes y 10 unidades de toxoide tetánico fijador en 1 ml. Los niños se vacunan a partir de los 3 meses de edad y se realizan revacunaciones: la primera al año y medio o 2 años, las siguientes a los 9 y 16 años, y posteriormente cada 10 años.

Gracias a la vacunación masiva, iniciada en la URSS en 1959, la incidencia de difteria en el país en 1966, en comparación con 1958, se redujo 45 veces, y su indicador en 1969 era de 0,7 por 100.000 habitantes. La posterior reducción del volumen de vacunación en la década de 1980 tuvo graves consecuencias. Entre 1993 y 1996, Rusia se vio azotada por una epidemia de difteria. Adultos, principalmente aquellos que no habían sido vacunados, y niños enfermaron. En 1994, se registraron casi 40.000 pacientes. En relación con esto, se reanudó la vacunación masiva. Durante este período, se vacunó a 132 millones de personas, incluidos 92 millones de adultos. Entre 2000 y 2001, la cobertura de vacunación infantil dentro del período establecido fue del 96%, y con la revacunación, del 94%. Debido a esto, la incidencia de difteria en 2001 se redujo 15 veces en comparación con 1996. Sin embargo, para reducir la incidencia a casos aislados, es necesario vacunar al menos al 97-98% de los niños durante su primer año de vida y asegurar la revacunación masiva en los años posteriores. Es improbable que la difteria se elimine por completo en los próximos años debido a la amplia transmisión de bacterias diftéricas toxigénicas y no toxigénicas. Además, la solución de este problema llevará tiempo.